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神経伝達物質であるノルエピネフリン(NE)及びセロトニン(5-HT)の脳内in vivo計測は、感情障害などの脳神経科学研究、抗うつ薬などの作用機序の解明や薬物療法の評価に重要である。本研究では、微小透析法を用いるラット脳内NE及び5-HTのプレカラムHPLC・同時蛍光定量法を開発した。本法の蛍光誘導体化原理は、NE及び5-HTがフェリシアン化カリウム存在下、弱アルカリ溶液中でベンジルアミンと反応し発蛍光することに基づく。
微小透析条件:SD系ラットを用いペントバルビタール麻酔下、脳アトラスに基づいて脳内微小透析用プローブを挿入。手術後1週間以上の回復期間をおいて実験を行う。ラットにリンゲル液(1μl/min)を無麻酔、無拘束の状態で潅流し、10分間おきの潅流液を貯留。誘導体化反応:脳透析サンプル10μlに、試薬溶液[0.3MCAPS緩衝液(pH12.0)-0.2Mベンジルアミン-0.1Mフェリシアン化カリウム-メタノール=1:1:5:10]10μlを加え、50°Cで20分間加熱後、その10μlをHPLCに注入。HPLC条件:Microboreカラム(100×1.0mm、i.d.)、充填剤TSKgel ODS-80TM;移動相、アセトニトリルーリン酸塩緩衝液(pH7.0)(31:69);流速、50μl/min.蛍光検出励起345nm、蛍光480nm.
ラット脳潅流液中NE及び5-HTは、単一溶離で15分以内に分離検出された。検出限度(S/N=3)は、50(NE)及び280(5-HT)amol/注入量と高感度であった。繰り返し精度は、5%以内と良好であった。本誘導体化法は、NE及び5-HTに対し高感度かつ高選択的であり、この高感度性により、脳内NE及び5-HTのin vivo計測を高分解能に行うことが初めて可能になった。
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