| 研究課題/領域番号 |
08672506
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
冨田 昌弘 三重大学, 工学部, 助教授 (20183494)
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| 研究分担者 |
小林 淳 三重大学, 工学部, 助手 (70242930)
宮嶌 成壽 三重大学, 工学部, 教授 (80239409)
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| キーワード | モノクローナル抗体 / 電気パルス融合法 / アビジン / ビオチン / B細胞選択 / ハイブリドーマ / クロスリンカー |
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| 研究概要 |
Lys残基およびCys残基と特異的に共有結合を形成することができるbifunctional cross-linkerであるMBS(m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide)を用い、目的のB細胞選択のための抗原-アビジンconjugateの作製を試みた。まず、初めに、アビジンのLys残基とMBS中に存在する官能基であるN-hydroxysuccinimideとを反応させ、抗原-MBS conjugateを作製した。このとき、アビジンに存在するCys残基は、すべてS-S結合を形成していたため、反応には関与しなかった。次に、抗原のCys残基をMBS中に存在するもう1つの官能基であるm-maleimidoと反応させ、チオエーテル結合を形成させ、抗原-MBS-アビジンconjugateを作製した。このconjugateの作製の有無は、抗アビジン抗体および抗原に対する抗血清を用い、western blotting法およびELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法にて検討した。その結果、目的の抗原-MBS-アビジンconjugateを確認することができた。次に、抗原-MBS-アビジンconjugateを用い、予め同じ抗原によって感作されたマウスのヒ臓細胞から目的の抗原に対する抗体産生B細胞を選び出し、B細胞一抗原-MBS-アビジンcomplexを得た。さらに、このcomplexをビオチン化されたミエローマ細胞と、アビジンとビオチン間の強い親和力を利用して、結合させ、最終的に、B細胞一抗原-MBS-アビジン-ビオチン-ミエローマ細胞complexを得た。このcomplexを電気パルスを利用して選択的に融合させたところ、最大で、全ウェル中ほぼ半数のウェルにハイブリドーマを確認することができた。
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