G蛋白共役型受容体の細胞内局在の分子機構

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08672555
• 研究機関: 国立小児病院
• 研究代表者: 辻本 豪三 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 部長 (80172013)
• キーワード: Green Fluorecent Protein / α1bアドレナリン受容体 / マウスαT3細胞 / Cキナーゼ

研究概要

【目的】薬物受容体の薬物感受性の変化を起こす要因として、受容体の細胞内局在の変化が示唆されている。近年、発光クラゲより強い蛍光を有するGreen Fluorecent Protein(以下GFP)が単離クローニングされた。このGFPは、他の標的蛋白との融合が容易に行え、いろいろな生物学の分野で用いられ、特に機能蛋白の細胞内局在・移動に関して知見が得られ始めている。今年度、交感神経α1受容体をモデルに、GFP融合受容体を作製・発現させた細胞での薬物刺激による受容体局在の変化に及ぼす情報伝達機構の検討を行った。
【研究方法】α1b受容体C端にGFP遺伝子を融合させたキメラ受容体を作製した。このキメラ受容体遺伝子をα1受容体を発現していないマウスαT3細胞に発現させ、得られた安定発現細胞集団を実験対象に用いた。レーザー共焦点顕微鏡を用い、薬物投与における局在の変化とカルシウムの変化の同時記録を行った。
【結果】細胞表面に一致して強い蛍光シグナルが観察され、α1b受容体は定常状態では細胞膜表面にその大多数が局在していると考えられた。一方、ノルアドレナリン刺激により受容体蛋白の細胞内移行が認められ、が30〜40%の受容体が細胞内へ移行した。α1bアドレナリン受容体internalizationを各種薬物ツール(TPA、タプシガ-ジン、PLC阻害剤等)にて薬理学的解析を行い、Cキナーゼが重要な役割を担っていることが示唆された。
【考察並びに結論】これまで不明であった細胞内局在による機能調節を調べる上で、特異抗体の作製・機能蛋白の細胞内局在の変化をリアルタイムでモニターすることは困難であった。しかし、今回試みたGFP融合による機能蛋白の標識技術を利用することにより生細胞での機能蛋白の局在・移動をリアルタイムで記録することが可能となった。今後このGFP融合による機能蛋白の標識技術を応用し、薬剤感受性の変化などにおける受容体蛋白の細胞内局在の影響などを検討する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Yazawa H,et.al.: "Oxytocin receptors are expressed and coupled to Ca^<2+> signaling in a human vascular smooth muscle cellline." Brit.J.Pharmacol.117. 799-804 (1996)
• [文献書誌] Hirasawa A,et.al.: "Flow cytometry analysis of α_1-adrenoceptor subtypes." FEBS Letter. 386. 141-148 (1996)
• [文献書誌] Nasu K,et.al.: "Quantification and distribution of α_1-adrenoceptor subtype mRNAs in humanprostate : comparison of benign hypertrophied tissues and non-hypertrophied tissue" Bri.J.Pharmacol.119. 797-803 (1996)
• [文献書誌] Saito H,et.al.: "Selective growth of human mast cells induced by steel factor,IL-6,and prostaglandin E_2 from cord blood mononuclear cells." J.Immunol.157. 343-350 (1996)
• [文献書誌] Shibata K,et.al.: "α_<1a>-Adrenoceptor polymorphism : pharmacological characterization and association with benign prostatic hypertrophy." Bri.J.Pharmacol.118. 1403-1408 (1996)
• [文献書誌] Awaji T,et.al.: "α_<1B>-Adrenoceptor-mediated calcium oscillation is specific for S phase in cell cycle and dependent on the extracellular calcium" Biochem.Biophys.Res.Commun.224. 80-86 (1996)
• [文献書誌] Tsujimoto G,et.al.(Edited by Uchida MK): "Receptor desensitization and Ca^<2+>-signaling-Cellular aspects of possible molecular dynamics-" Japan Scientific Societies Press., 22 (1996)
• [文献書誌] 辻本豪三,他: "薬の正しい使い方(日本医師会生涯教育シリーズ)" 医学書院, 3 (1996)