| 研究概要 |
プロスタグランジンD合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11-エピジオキシ基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造決定によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築等を行った。NMR測定に必要な20-40mgの試料を効率的かつ経済的に得るために、1-2Lの大腸菌培養でNMR測定に必要な量を確保出来るようにした。既にPGDSのcDNAはラットより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれている。培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/L-20mg/L以上の収量を達成した。そして、M9最小培地で大腸菌の栄養源に^<13>Cラベル化グルコース、^<15>Nラベル化塩化アンモニウムを用いて産出される蛋白質を100%NMR観測可能な安定同位体でラベルした。この時、ラベル化合物のコストを考慮してM9最小培地で必要なグルコース、塩化アンモニウムの量を最小限に抑えるようにした。^<15>N-^1HHMQCスペクトルではPGDSの立体構造を反映して各ピークの化学シフト値は分散していた。またβシートに特徴的な低磁場シフトしたCαHシグナルが観測された。現在、COSY、NOESY等の2次元NMRスペクトル及びNOESY-HMQC、TOCSY-HMQC等の3次元NMRスペクトルによりシグナルの帰属を行っている。
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