1996 年度実績報告書

ATP合成酵素におけるエネルギー共役機構と回転モデルの検証

研究課題

研究課題/領域番号	08680689
研究機関	岡山大学
研究代表者	金澤浩岡山大学, 工学部, 教授 (50116448)
研究分担者	大塚智恵 (守谷智恵) 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 助手 (60253001)
キーワード	H^+輸送性ATPase / 再構成ATPase / エネルギー共役の分子機構 / 生体膜エネルギー転換系 / Two-hybrid実験系
研究概要	生物界に普遍的に存在しエネルギー獲得機構にとって不可欠なATP合成酵素(F_1F_0)は、8種のサブユニットからなる複雑な高次構造を持ち電子伝達系で形成されたベクトリアルな水素イオンの酵素内の移動をATP合成のエネルギー源とするというユニーク機能発現機構を有している。この酵素は逆反応としてATPを加水分解して得られるエネルギーを利用してH^+を排出するポンプ機能を有している。しかし、このエネルギー共役の機構の分子レベルでの解明はなされていない。本研究の目的は、大腸菌ATP合成酵素のF_1-ATPase部分のうち特にαβ複合体がγサブユニットを軸とするモーター構造を有することを、回転を視覚化することにより検証するための基礎的研究をすること。またモーターを形成するATPaseサブユニットの分子間相互作用を新たな手法をもちいて明らかにし、生物分子モーターの構造的実体を明らかにすることである。本年度は、回転を可視化するための材料として固相に固定するATPaseの再構成系の確立を目指し、これに成功し論文とした(B.B.A.(1996)1273,62-70).すなわち、デルタ、またはイプシロンサブユニットにグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を融合したサブユニットを作製し、これに正常なATPaseを再構成し固相に結合する事ができた。また最近本酵素の膜結合性サブユニットの一つであるbサブユニットの細胞質への突出部分をもつ融合タンパク質を作製し、これにも再構成を行う実験系を確立できた(論文準備中)。これらの実験系を用いて当初の目的である回転の可視化の系を確立する目途がたった。一方、本酵素のなかで立体的なサブユニットの配置が未解明なストーク領域についてサブユニットの相互作用を調べるために新たに酵母を用いるTwo-hybrid系を確立した(B.B.A.(1996)1274,67-72).この結果ガンマとイプシロンサブユニット、およびbとデルタサブユニットの強固な結合の存在を明らかに出来た。この実験系を用いて結合が失われる突然変異の分離と解析にも成功した(論文準備中)。今後、本酵素のエネルギー共役の実体を理解する上でこれらの知見は有用となろう。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Shin,Y.: "Reconstitution of the F1-ATPase activity from purified α,β,γ,and δ or ε subunit with glutathione S-transferase fused at their amino termini" Biochem.Biophys.Acta. 1273. 62-70 (1996)
[文献書誌] Moritani-Ohtsuka,C.: "Interactions of the F1-ATPase subunits from Escherichia coli detected by the yeast two-hybrid system" Biochem.Biophys.Acta. 1274. 67-72 (1996)
[文献書誌] Yabuki,M.: "Catalytic and structural importance of Gly 454,Tyr-455 and Leu-456 in the carboxy-terminal region of Escherichia coli F1-ATPase α subunit" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).
[文献書誌] Noumi,T.: "Identification and characterization of functional residues in Na^+/H^+ antiporter(NhaA)from Escherichia coli by random mutagenesis" J.Biochem.(印刷中).
[文献書誌] Moritani-Ohtsuka,C.: "Identification of two peptides interacting with rat Ha^+/H^+ exchanger 1 and 3 with the yeast two-hybrid system" FEBS Lett.(印刷中).
[文献書誌] Shin,Y.: "Escherichia coli F1-ATPase subunit interactions:β and γ subunit peptides inhibit in vitro reconsitution of the active αβγ complex" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).

1996 年度 実績報告書

ATP合成酵素におけるエネルギー共役機構と回転モデルの検証

研究代表者

金澤 浩 岡山大学, 工学部, 教授 (50116448)

研究成果

[文献書誌] Shin,Y.: "Reconstitution of the F1-ATPase activity from purified α,β,γ,and δ or ε subunit with glutathione S-transferase fused at their amino termini" Biochem.Biophys.Acta. 1273. 62-70 (1996)

[文献書誌] Moritani-Ohtsuka,C.: "Interactions of the F1-ATPase subunits from Escherichia coli detected by the yeast two-hybrid system" Biochem.Biophys.Acta. 1274. 67-72 (1996)

[文献書誌] Yabuki,M.: "Catalytic and structural importance of Gly 454,Tyr-455 and Leu-456 in the carboxy-terminal region of Escherichia coli F1-ATPase α subunit" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).

[文献書誌] Noumi,T.: "Identification and characterization of functional residues in Na^+/H^+ antiporter(NhaA)from Escherichia coli by random mutagenesis" J.Biochem.(印刷中).

[文献書誌] Moritani-Ohtsuka,C.: "Identification of two peptides interacting with rat Ha^+/H^+ exchanger 1 and 3 with the yeast two-hybrid system" FEBS Lett.(印刷中).

[文献書誌] Shin,Y.: "Escherichia coli F1-ATPase subunit interactions:β and γ subunit peptides inhibit in vitro reconsitution of the active αβγ complex" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).

1996 年度実績報告書

金澤浩岡山大学, 工学部, 教授 (50116448)