神経内分泌小胞膜に普遍的に存在する膜貫通チトクロムb_<561>の構造と機能

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08680727
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 鍔木 基成 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (00145046)
• キーワード: ビタミンC / アスコルビン酸 / シトクロムb_<561> / ノルアドレナリン / カテコールアミン / クロマフィン小胞 / 副腎髄質 / ヘム

研究概要

1チトクロムb_<561>の精製法の確立ウシ副腎髄質からクロマフィン小胞を精製した後、アスコルビン酸(AsH)存在下で膜を1.0%β-オクチルグルコシドにより可溶化し、ω-aminooctyl Sepharose4Bによる疎水性アフィニティークロマトグラフィーによりチトクロムb_<561>を高純度に精製した。
2精製チトクロムb_<561>のヘム含量ピリジンヘモクローム法により、精製チトクロムb_<561>標品のヘム含量を測定した結果、1分子あたり1.70個のヘムBが結合していることがわかった。
3EPR法による精製チトクロムb_<561>活性部位の解析ヘムの酸化還元に伴って変動する3つのlow-spin分子種(gz=3.70,gz=3.16,gz=2.84)を観測した。チトクロムb_<561>分子の2つの独立なヘム結合部位を示唆している。
4弱アルカリ処理・DEP処理による選択的不活性化精製チトクロムb_<561>を酸化状態で弱アルカリあるいはDEP(diethylpyrocarbonate)処理を行うと、2つのヘムの内の一方がAsHでは還元できなくなることがわかった。
5パルスラジオリシス法による電子伝達機構の解明パルスラジオリシス法によるモノデヒドロアスコルビン酸ラジカル(MDA)と還元型チトクロムb_<561>との電子伝達反応の解析を行った。その結果、チトクロムb_<561>では、MDAによる酸化過程とAsHによる還元過程はそれぞれ別のヘム鉄で起こっていることが明らかとなった。
6チトクロムb_<561>膜貫通モデル以上の研究成果をもとに、チトクロムb_<561>の6回膜貫通モデルを提唱した。2つのヘムはクロマフィン小胞膜の細胞質側と小胞内側という両端に位置し、2つの完全に保存されている配列はそれぞれ2つのヘムのすぐ近傍に位置することになり、それぞれ、細胞質側でのAsH結合部位、小胞内でのMDA結合部位を形成していると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Saiki, K.: "Exploring subunit-subunit interactions in the Escherichiacoli bo-type ubiquinol oxidase by extragenic suppressor mutation analysis" J. Biol. Chem.272. 14721-14726 (1997)
• [文献書誌] Hirano, T.: "A novel chloride-binding site modulates the heme-copper binuclear center in the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase" J. Biochem.122. 430-437 (1997)
• [文献書誌] Tsubaki, M.: "Existence of two hemeB centers in cytochrome b_<561> from borine adrenal chromaffin vesicles as revealed by a new purification procedure and EPR spectroscopy" J. Biol. Chem.272. 23206-23210 (1997)
• [文献書誌] Tsubaki, M.: "Resonance Raman, FT-IR and EPR investigation on the binuclear site structure of the heme-copper ubiquinol oxidase from Acetobacter aceti" Biochemistry. 36. 13034-13042 (1997)
• [文献書誌] Tsubaki, M.: "20β-Hydroxy-C21-Steroid 20β-oxidase activities of Cytochrome P450C21 purified from bovine adrenocortical microsomes" Biochim. Biophys. Acta. 1390. 197-206 (1997)
• [文献書誌] Okuyama, E.: "Structural basis of the electron transfer across the chromaffin vesicle membranes catalyzed by cytochrome b_<561>" Biochim. Biophys. Acta. (in press). (1998)