| 研究概要 |
yeast two-hybrid systemを用いてライブラリーをスクリーニングし見い出された、2種のp53結合蛋白質、53BP1、53BP2の機能について検索を行った。GSTとの融合蛋白、GST-53BP1,GST-53BP2を精製し、ウサギに免疫し、抗53BP1抗体、抗53BP2抗体を得た。抗53BP1抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを施行したところ、正常線維芽細胞W138細胞抽出液中に230KDの蛋白が検出されたが、p53欠失細胞株H358(肺癌細胞株)Saos-2(骨肉腫細胞株)の細胞抽出液中は検出されなかった。2種のヒトcDNAライブラリーをスクリーニングし、1972アミノ酸残基から成るfull sizeの53BP1cDNAを得た。HA-Tagを付けた53BP1をH358細胞に発現させると、HAに対するモノクローナル抗体12CA5を用いたウエスタンブロッティングで約230KDの蛋白が検出された。53BP2のfull sizecDNAはStanford大学のNaumovski博士より供与を受けた。53BP1,53BP2をCOS-1細胞に発現させ免疫染色を施行したところ、両蛋白とも細胞質内に局在した。H358細胞へ、p53により転写が活性化されるCATレポータープラスミドと供にp53発現プロスミドを導入し、CATアッセイを施行した。さらに、この系に53BP1または53BP2を同時に発現させ、p53による転写活性化に対する53BP1,53BP2の影響を検討したところ、53BP1はp53による転写活性化を抑制し、53BP2は増強させた。今後、p53による転写活性化機能の53BP1,53BP2による修飾の機序について検討する予定である。
|
