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C型慢性肝炎患者肝生検組織におけるウイルスRNAの分布とインターフェロンの効果との関連性を明らかにすることを最終的な目標に据えて研究を開始した。まず、組織中のウイルスRNA分布を高感度にしかも特異性高く検出するための方法としてRT in situ PCR法を採用し、その至適反応条件を求める予備実験を行った。Nuovoらによって提唱された方法に従い、4μm厚のパラフィン切片を脱パラフィン、除タンパク処理後、DNase溶液で37℃17時間インキュベートし、DNA消化を行った。次に、逆転写酵素とHCVに対する特異的アンチセンスプライマーを用いて組織切片上でcDNAを合成、さらにDNAポリメラーゼ、センスプライマー、アンチセンスプライマーを含むPCR溶液にジゴキシゲニン標識したdUTPを加えて切片にのせ、サーマルサイクラ-でPCRを行った。HCV感染3例、HBV感染1例を検討したところ、HBV感染例でも陽性所見が出るなど、特異性にやや問題があることが明らかとなった。特異性の改善と手技の簡素化を図るべく、逆転写とDNA増幅が一度に行えるTthポリメラーゼとジゴキシゲニン標識プライマーを用いた改変In situ PCRを案出し、同様に至適反応条件を求めた。その結果、肝細胞および門脈域単核細胞の細胞質にHCVに対する染色が得られ、その染色パターンは以前にIn situハイブリダイゼーションで得られた結果に類似していた。B型慢性肝炎症例では瀰漫性にかすかな背景染色を見るのみで、特異的な染色は観察されなかった。以上より、簡便で特異性の高いHCV染色法が確立出来たと考えられ、今後は本手技をもって更なる組織化学的検討を加えていきたい。
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