| 研究課題/領域番号 |
08838036
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 応募区分 | 時限 |
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| 研究機関 | (財)東京都老人総合研究所 |
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研究代表者 |
藤田 敬子 東京都老人総合研究所, 分子生物学部門, 助手 (00100131)
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| 研究分担者 |
丸山 直記 東京都老人総合研究所, 分子病理部門, 研究部長 (00115940)
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| キーワード | SMP30 / 老化マーカー蛋白質 / 細胞内カルシウムホメオスタシス / カルシウム結合蛋白質 / 肝臓 / ノックアウトマウス / 老化 / ジーンターゲッテイング |
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| 研究概要 |
我々は、加齢に伴って肝臓で減少してくる新しいカルシウム結合性肝臓蛋白質を発見しSMP30と命名し研究を進めている。SMP30は高い相同性をもってヒトをも含めた高等動物のみに保存されていて、その生理機能として細胞内カルシウム濃度のホメオスターシスやカルシム依存性酵素活性の制御などが示唆されている。本研究はSMP30の生理機能を解明するするためにジーン・ターゲッテイング法によるSMP30遺伝子を破壊したマウス(ノックアウトマウス)の作製を行なう。本年度はマウス129SMP30ゲノミック遺伝子をクローニングしターゲッテイングベクターの構築まで行なうことができた。
1.前年度クローニングしたB6マウスSMP30遺伝子(pgM5)は全mRNAをカバーしていると考えられたのでSMP30遺伝子の全ゲノム構造を決定した。
2.用いるES細胞がマウス129由来のため、マウス129ゲノミックライブリーよりホモロ-ガスコンビネーションに必要な部位のSMP30遺伝子をB6マウスSMP30遺伝子構造を参考にしてクローニングし構造決定した。
3.マウス129ゲノミックSMP30遺伝子のゲノム構造ならびに制限酵素地図、塩基配列を基にしてターゲッテイングベクター作製のためのストラテジーをデザインした。ポジテイブ選別にneo耐性遺伝子、ネガテイブ選別にはジフテリア毒素Aフラグメント(DT-A/A+Tpau)遺伝子を用い、ターゲッテイングベクターならびにコントロールベクターのコンストラクトを構築することができた。
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