| 研究概要 |
これまで、遺伝子組み替えの技術を使って色々なコンストラクトを作成し、遺伝子導入T細胞株を樹立・解析した。カルシニューリンA鎖の自己抑制部位の欠損した遺伝子断片やPCR法で胸腺細胞のライブラリーからクローニングしたA鎖のカルモジュリンの結合部位のみコードした遺伝子、B鎖結合部位のみコードした遺伝子などを作成した。これらの遺伝子断片を種々の発現ベクターに組み込みT細胞株に遺伝子導入を行った。遺伝子導入が蛋白質に翻訳されているかどうかは,抗体などを用いてイムノブロッティング法で確認した。この中で、酵素活性を持たないカルシニューリンA鎖で作製した遺伝子導入株はTCR刺激によるリンホカイン産性能が無く、dominant-negative様の作用を示していることが分かった。NF-ATの核内移行への影響はgel shift assayを用いて解析したが、これも抑制されていることが分かった。
平成9年度は、T細胞の活性化を変化させることがわかった遺伝子について、近位lckのプロモーターを利用したトランスジェニックマウス作成用のカセットを使ってトランスジェニックマウスを作成した。酵素活性のないカルシニューリンのdominant-negativeトランスジェニックマウスが3ライン樹立された。トランスジェニックマウスの胸腺細胞や末梢T細胞の機能については、1)抗TCR抗体での刺激によるリンホカイン産生能のを調べ、低下していることがわかった。2)T細胞の分化について胸腺細胞のCD4/CD8の染色像は正常にくらべて大きな変化はなかった。しかし、胸腺細胞の数が3分の1に低下しており、胸腺細胞の寿命の低下が示唆された。3)抗TCR抗体での刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇については、フローサイトメトリーとコンピューター画像解析装置を用いたが、正常であった。
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