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表面を細切し成熟培養可能なCOCを採取した後のウシ卵巣をミンチにした。この卵巣片10gを200mLの0.5mM EDTAを含むカルシウム、マグネシウム欠のハンクス液中で30℃で15分間マグネチックスターラーでゆっくりと攪拌、洗浄した後、コラゲナーゼによる卵胞回収に用いた。コラゲナーゼは200単位/mLになるようにハンクス液に溶解し、pHを7.4に調節した物を用いた。洗浄後の卵巣片を100mLのコラゲナーゼ液に懸濁し、30℃で3時間マグネチックスターラーでゆっくりと攪拌した。1時間毎に1mmのメッシュを用いて、卵巣片を回収し、ロ液をハンクス液で遠心洗浄、後実体顕微鏡下で卵胞を回収した。直径50-100μmの卵胞腔形成以前の卵胞を選別し、95%空気、5%CO_2の湿潤気相下で十日間培養を行った。培養はMaCoy's 5A培地に0.04μg/mLヒドロコルチゾン、6mg/mLグルコースとITSを添加したものを用い、2mg/mL濃度のコラーゲンゲル包埋培養法と30μLのドロップ中での静置培養法で行った。
コラーゲンゲル包埋培養法では卵胞は発育せず、培養終了後に正常な卵母細胞も回収できなかったが、静置培養法では平均76%の卵胞で細胞分裂が確認され、7.8%(16/204)の卵胞で培養後正常な卵母細胞が回収できたが、培養開始時と、培養終了時の卵母細胞の直径には有意な差は認められなかった。
今回の実験に用いた段階の卵母細胞の発育を示す適当なマーカーが知られていないため、卵母細胞の直径増加以外に発育を推測する方法は存在しない。今後はより長期間安定して培養可能な系を確立すると、卵母細胞の発育に関連するマーカーの発見が重要である。
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