転写膜上での酵素活性を指標とした直接遺伝子クローニング技術の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08877032
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 山村 博平 神戸大学, 医学部, 教授 (90030882)
• 研究分担者: 柳 茂 神戸大学, 医学部, 助手 (60252003)
• キーワード: 遺伝子クローニング法 / 酵素活性 / ニトロセルロースフィルター / Denature-Renature

研究概要

我々は、以前よりプロテインキナーゼの酵素活性を指標として蛋白を精製し、部分アミノ酸配列を決定した後、遺伝子クローニングを行ってきた。しかしながら近年、膜フィルター上で失活した酵素活性が復元できる技術が開発され、新しい遺伝子クローニング法へ応用が可能となった。基本原理は、大腸菌から発現ライブラリーで発現させた蛋白を抗体等でスクリーニングする従来の方法をさらに応用し、ニトロセルロースフィルター上で本来酵素活性をもつ蛋白質をグアニジンおよび還元剤処理等によるDenature-Renature法でその高次構造を復現させた後、フィルター上で酵素活性を検出させて目的とするクローンを直接選び出す方法である。この方法が確立すれば既知のあるいは未知の酵素群を直接クローンを選び出すことが可能となり、画期的な遺伝子クローニング法となると考えられる。
予備的な実験において単純なプロテインキナーゼの系では成功している。現在、様々な困難に直面しており開発中である。さらなる創意工夫が実用化への鍵になるものと思われる。この方法が確立し、実用化すれば未知の酵素群を精製せずしてクローニングすることが可能となり、画期的な遺伝子クローニングとなると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Qin,S.et.al.: "Cooperation of tyrosinekinases p72 syk and p53/56 lyn regulates calcium mobilization in chicken B cell oxidant stress signaling." Eur.J.Biochem.236(2). 443-449 (1996)
• [文献書誌] Minami,Y.et.al.: "Role of protein-tyrosine kinases in stress signaling." J.Deuterium Sci.5(1). 11-14 (1996)
• [文献書誌] Nakamura,T.et.al.: "Sigunal transduction through μκ B-cell receptors expressed on pre-Bcells is different from that through B-cell receptors on mature B cells." Immunology. 88. 593-599 (1996)
• [文献書誌] Yanagi,S.et.al.: "CD45 Modulates phosphorylation of Both Autophosphorylation and Negative Regulatory Tyrosines of Lyn in B Cells." J.Biol.Chem.271(48). 30487-30492 (1996)
• [文献書誌] Wang,X.et.al.: "Tyrosine Phosphrylation and Syk Activation Are Involved in Thrombin-Induced Aggregation of Epinephrine-Potentiated Platelets." J.Biochem.121(2). 325-330 (1997)
• [文献書誌] Qin,S.et.al.: "Syk-dependent and -independent Signaling Cascades in B Cells Elicited by Osmotic and Oxidative Stress." J.Biol.Chem.(in press).