培養肺胞上皮細胞気管内注入による肺病変修復促進の分子生物学的検索

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08877241
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 須賀原 一博 熊本大学, 医学部, 助教授 (20171126)
• 研究分担者: 田代 雅文 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (60264305)
• キーワード: 急性肺障害 / 肺胞上皮細胞 / 培養細胞 / 気管内注入 / 細胞増殖因子 / In situハイブリダイゼーション

研究概要

1.培養肺胞II型上皮細胞気管内投与による投与細胞の動態-ラット肺より肺胞II型上皮細胞を分離し、細胞が培養皿に付着しないようにバクテオロジカルデイシュに一日培養し、4-diamino-2-phenylindole(DAPI)を用いて細胞核を染色してから他のラット肺に気管内投与した。数日後ラット肺を凍結固定し、凍結切片を作成して蛍光顕微鏡にて観察すると、投与した細胞が塊を作って肺胞壁に付着しており、形態的に生きている細胞が確認された。培養細胞を肺胞上皮細胞増殖因子であるKGFで、12時間刺激しDAPIで染色後、気管内投与してその動態を検索し、同様の結果を得ている。現在、細胞をマークしないで(少し細胞障害があると思われるため)気管内投与し、投与肺を組織学的、電顕的に検索している。肺表面活性物質アポ蛋白質SP-Aの抗体による免疫組織化学的検索でも、気管内投与したと思われる細胞にSP-A陽性が観察された。
2.呼吸不全動物肺での細胞動態変化-エンドトキシン、ブレオマイシンや塩酸による障害ラットを作製し、KGFで刺激した培養肺胞II型上皮細胞を呼吸不全動物ラット肺に気管内投与し、その投与細胞の動態を検索しているが、肺水腫などが強いためか肺胞壁まで達していなく付着した細胞が少ない。最適投与時期を検索するため、経時的な変化を観察している。また、DAPIの細胞内取り込みがあまりよくないので、ダイオ-なとの他のマーカーも用いた細胞動態の検索を検討している。
3.KGF刺激培養肺胞上皮細胞と人工サーファクタント併用による肺障害抑制効果-予備実験でKGF刺激培養細胞投与による肺障害抑制効果がはっきりしなかったので、人工サーファクタントとの併用効果を試みて居るが、急性期には肺水腫が著しく投与物質が肺胞に達しないと思われ、効果があまり見られなかった。現在経時的に投与日を変え効果のある時期を検索中である。さらに、プロテアーゼ阻害薬などの併用効果も検索中である。
4.今後の展望-肺障害作製後人工呼吸管理を併用して(初期の肺水腫を抑えて)KGF刺激培養細胞を投与する研究を検討している。さらに、アデノウイルスを用いたgene transferによる研究も検討し始めている。

研究成果

• [文献書誌] Sugahara,K.et al: "Differential expression of the transcription factor,C/EBP- and in lung injury and fibrosis in rats." Am.J.Respir.Crit.Care Med.155(in press). (1997)
• [文献書誌] Sugahara,K.,et al: "Overexpression of surfactant protein SP-A,SP-B and SP-C mRNA in rat lungs with lipopolysaccharide-induced injury." Laboratory Investigation. 74. 209-220 (1996)
• [文献書誌] Sugahara,K.,et al: "Role of alveolar epithelial proliferation and surfactant protein in acute lung injury." J.Jpn.Med.Soc.Biol.Interface. 26. 101-113 (1996)
• [文献書誌] Sugahara,K.,et al: "Keratinocyte growth factor (KGF) prevents bleomycin-induced lung fibrosis in rats." Am.J.Respir.Crit.Care Med.153. A642-a642 (1996)
• [文献書誌] 須加原一博,他: "Keratinocyte growth factor (KGF)による肺胞上皮細胞の増殖、分化と肺サーファクタント・アポ蛋白遺伝子発現動態" 日本界面医学会雑誌. 27. 151-153 (1996)
• [文献書誌] 須加原一博: "ARDSにおける肺胞上皮細胞の増殖・分化と肺サーファクタント・アポ蛋白質遺伝子発現動態" 日本臨床. 54. 61-65 (1996)
• [文献書誌] 須加原一博: "Annual Review呼吸器1996" 中外医学社(東京), 256 (1996)