| 研究概要 |
私共は、HSG細胞におけるレチノイン酸(RA)による増殖や分化の分子機構をレチノイン酸レセプター(RAR)による転写制御を中心に検討してきた。最近、私共はRARの転写制御におけるヘテロダイマーパートナーであるRXRをHSG細胞よりクローニングしたが、この際、RXRファミリーに属しRA作用の負の制御に関与すると考えられているCOUP-TFIもクローニングされた。そこで本年は、RAによるRARを介した転写調節系へのRXRならびにCOUP-TFIの関与を調べるため、以下の実験を行った。
(1)COUP-TFI抗体の作成
抗体作成のための抗原タンパクを得るため、大腸菌におけるCOUP-TFIの発現実験を試みた。まず、COUP-TFIのcDNAを大腸菌発現ベクターに組み込み、これを用いて大腸菌TG1細胞をトランスフォームさせ組換体を作成した。この大腸菌における組換体COUP-TFIタンパクが安定して発現しているかについては現在検討を行っている。一方、COUP-TFIのN末端側のunique配列を利用したペプチド抗体は現在作成中である。
(2)ゲルシフト法によるDNA結合能の解析
これまでに、RARはRXRとヘテロダイマーを形成することによりレチノイン酸応答配列(Retinoic Acid Responce Element,RARE)と結合することが明らかとなっているので、本実験においては、RARとRAREとの結合に対するCOUP-TFIの存在の影響をゲルシフト法により調べた。COUP-TFIはホモダイマーとしてRAREと濃度依存的に結合した。In vitro発現RAR-RXRヘテロダイマーあるいはHSC核抽出物(0.4MKCl)とRAREとの結合の際にin-vitro発現COUP-TFIが共存すると、RAREとの結合バンドの強度は有意に減少し、COUP-TFIとRAREとの結合バンドとみられる第二のバンドが出現した。これらの結果より、COUP-TFIはRAR-RXRヘテロダイマーとRAREとの結合を抑制することによりRAによる転写活性化を制御する働きを担っていることが推測された。
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