染色体上の特定位置に遺伝子導入できるAAVベクター系の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08877346
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 島田 隆 日本医科大学, 医学部, 教授 (20125074)
• キーワード: 遺伝子治療 / 組換えウイルスベクター / アデノ随伴ウイルス / AAVベクター

研究概要

安全性が非常に高く、非分裂細胞への遺伝子導入も可能であるという遺伝子導入用ベクターとして理想的な特性を有しているAdeno associated virus(アデノ随伴ウイルス:AAV)ベクターもウイルス粒子としてパッケイジングするための導入遺伝子サイズの制約や野生型AAVが持つヒト第19染色体の長腕(q13.4-ter)への部位特異的な挿入が行えない等の問題点を有している。そこで、これらの問題点を克服するための一歩として、AAV蛋白質Rep78遺伝子(1.81.9kb:AAV233-2233;7.8kDa)を大腸菌用融合蛋白質発現ベクター(pMal-c)に組込み、大腸菌内でmaltose binding proteinとRep78のfusion proteinを大量に発現する系を確立し、これを抗原とした抗-Rep78ウサギ・ポリクローナル抗血清を作成した。この抗血清はCAGプロモーターにドライブされたAAV蛋白質Rep78遺伝子を持つプラスミドを293細胞へ遺伝子導入して得た核抽出分画のウエスタン分析において、市販のAAV Rep proteinモノクローナル抗体(PROGEN;226.7)と同一のバンドを認識し、大腸菌で、Rep蛋白質が発現している事を確認した。このRep fusion proteinを血液凝固因子Xaにて加水分解すると、ほぼRep78蛋白質に相当する分子量約76kDaが分離できた。発現させたfusion proteinおよび分子量約76kDの蛋白質の1)ATP-dependent DNA helicase活性、2)AAVS1-specific DNA binding活性、3)ITR binding活性などの生理活性を検討したが、Positive controlがうまく取れないため、明確な活性を証明できなかった。現在、Rep fusion proteinをHeLa細胞、293細胞へAAVベクター遺伝子と伴にリポフェクションによって導入し、部位特異的な挿入が行えるかを検討中である。また、センダイウイルスの膜融合能を持つ単層リポゾーム内にAAVベクター遺伝子と、AAV非構造蛋白質のRep78とを抱合させたSendai virosomesを用いて導入する方法をNakanishiら共同で行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Shimada,T.: "Targeted gene transfer into CD4 positive cells by HIV based retrovital vevtors." Molecular Biology of Hematopoiesis. 323-329 (1996)
• [文献書誌] Tamayose,K.: "A new strategy for large scale preparation of high titer recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors by using packaging cell lines and sultonated column." Human Gene Therapy. 7. 507-513 (1996)
• [文献書誌] Shimada,T.: "Current status and future prospects of human gene therapy." Acta Pediatrica Japonica. 38. 176-181 (1996)
• [文献書誌] Obaru,K.: "Gene therapy for adult T cell leukemia using human immunodeficiency virus vector carrying the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1." Human Gene Therapy. 7. 2203-2208 (1996)
• [文献書誌] Miyake,K.: "Two step gene transfer using adenovirus vector carring the CD4 gene and HIV vectors." Human Gene Therapy. 7. 2281-2287 (1996)