シトクロムb_5遺伝子の発現調節と機能解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09044092
• 研究機関: 高知大学
• 研究代表者: 指吸 俊次 高知大学, 理学部, 教授 (00019564)
• 研究分担者: ポーター トッドD. ケンタッキー大学, 薬学部, 助教授 ; ステッグルス アランW. ノースイースタンオハイオ大学, 医学部, 教授 ; キャンベル ウイルパーH ミシガン工科大学, 生命科学部, 教授
• キーワード: シトクロムb5遺伝子 / cDNAクローニング / リコンビナントb5 / 硝酸還元酵素 / シトクロムP450 / 薬物代謝 / ホルモン代謝

研究概要

本共同研究では、シトクロムb5遺伝子の発現調節機構の解明と、タンパク質レベルでの機能解明のために、以下のような研究を行った。
1. 指吸は、海産無脊椎動物であるホヤのシトクロムb5のcDNAを2種類のホヤからクローニングした。ミサキマメイタボヤのcDNAは約1.8kbで、ユウレイボヤのb5cDNAは790bpで、両者とも哺乳動物b5のアミノ敢配列と約75%のホモロジーがあった。各々の可溶性b5発現系を構築し、大腸菌で発現させ精製し、性質をしらべ、哺乳動物のb5とよく似た性質をもつことを明かにした。
2. ステッグルスは、ブタ副腎から膜結合型、可溶型シトクロムb5のcDNAをクローニングし、それらの構造を決定した。ブタ副腎のシトクロムb5cDNAには、ヒト、ウサギのcDNAと同様に96番目のGluの後に24塩基の挿入配列があり、可溶性b5をコードする構造が発見された。また、副腎における膜結合型、及び可溶性シトクロムb5の発現はホルモン代謝と関連しており、シトクロムb5の発現がホルモン代謝に影響を与えることを明かにした。
3. ポーターは、ラット小胞体における薬物代謝にシトクロムb5がいかに関与するか調べるために、遺伝子組換えによりシトクロムb5、シトクロムP450、シトクロムP450還元酵素の各cDNAをpIN4ベクターに接続し、これらが同時に発現する発現系を開発した。シトクロムb5を同時に発現させた場合、薬物代謝機能は明かに上昇することが明らかとなった。
4. キャンベルは、硝酸還元酵素に含まれるシトクロムb5ドメインの役割を解析した。植物の硝酸還元酵素は、FAD結合ドメイン、シトクロムbドメイン、モリブドプテリンドメインが自然に融合したタンパク質である。本研究では、FAD結合ドメインとシトクロムbドメインを同時に大腸菌で発現させ、分子内での電子伝達機能を解析した。

研究成果

• [文献書誌] Yanase,T.et al.: "Immunohistochemical Study on Cytochrome b5 in Human Adrenal Gland and in Adrenocortical Adenomas from atient with" Endocrine Journal. 45(1). 89-95 (1998)
• [文献書誌] Shiraishi,N.et al.: "Engeneering of pyridine nucleotide specificity of nitrate reductase:Mutagenesis of recombinant cvtochrome v reductase fragment of New" Arch.Biochem.Biophys.358. 104-115 (1998)
• [文献書誌] VanDenMrak,PK.et al.: "The isolanon and characterization of the soluble and membranebound porcine cvtochrome b5 cDNAs." Biochem.Biophys.Rse.Commun.240. 80-83 (1997)
• [文献書誌] Ramam,K.et al.: "Spectroscopic and kinetic characterization of the recombinant cvtochrome c reductase of nitrate reductse:identification of the rate lin." J.Biol.chem.272. 2122-2128 (1997)
• [文献書誌] Tang,Y.: "Deletion Analysis of the FAD Domain of NADPH-Cytochrome P450 Reductase." Flavins and Flavoproteins. 1996. 479-482 (1997)
• [文献書誌] Shiraishi,N.,Campbell,W.H.: "Expression of Nitrate Reductase FAD-Containing Fragments in Pichia" Flavins and Flavoproteins. 1996. 931-934 (1997)