| 研究課題/領域番号 |
09044224
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
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| 研究分担者 |
クック ポール・F オクラホマ大学, 化学生化学部, 教授
田辺 忠 国立循環器病センター研究所, 薬学部, 部長 (60025624)
長澤 透 岐阜大学, 工学部, 教授 (60115904)
緒方 靖哉 九州大学, 農学部, 教授 (20038277)
大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
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| キーワード | C1微生物 / メチロトーフ / Hyphomicrobium methylovorum / セリーングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ / ヒドロキシビルビン酸レダクターゼ / X線結晶解析 / 動力学的反応機構 |
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| 研究概要 |
今年度の本研究の研究実績はつぎのようにまとめられる。
(1) C1微生物に特異な新規酵素SGATの精製酵素の大量調製
C1微生物HyPhomicrobium methylovorumの特異な新規酵素セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(SGAT)についての研究を行うため、すでに取得しているそれぞれの高発現大腸菌形質転換株より本酵素の効率的精製法を改良し大量精製法を確立した。すなわちまず高活性組換え菌株E.coliHB101/pKK20-3 SGAPからのSGATの精製をおこなった。培養液7literから湿重量29.5gの菌体を得、ソニックにより無細胞抽出液76.0mlを取得した。その後硫酸アンモニウム分画、DEAE-sephacel、Sepharose 6Bゲルろ過クロマトグラフィーを行ったのち、活性画分を回収、限外ろ過濃縮した。その結果、総タンパク質量37.2mg、全活性3370Uの酵素溶液2.2mlを取得した。最終段階において収率27.2%で33.8倍に精製されたSGAT37.2%を取得した.SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により各精製段階における精製状況の確認のために各段階の精製標品を用いて、2.8.3の方法に従いSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果最終精製酵素はほぼ均一であった。
(2) C1微生物に特異な新規酵素SGATの結晶化条件の検討
上で得られた酵素溶液を用いて良質の結晶を得るための結晶化条件のスクリーニングを行った。まず、CRYSTAL SCREENの50種の条件で結晶化を行った結果、No.1の条件(0.02M Ca Chloride、0.IMNa Acetate pH 4.6、30%2-メチル2,4ペンタンジオール(MPD))でSGATM結晶と思われるものが得られた。この結果を参考CRYSTAL SCREENのNo.1の条件の各組成の濃度を変化させ、NaAcetateのpHを7.0に変えた条件でさらにスクリーニングを行った。その結果、最もMPDの濃度が低い条件(0.02MCaChloride、0.1M Na Acetate pH7.0、10%MPD)で結晶が得られた。この結果を参考に次にMPDの濃度を下げた条件でスクリーニングを行い、結晶化を試みたところ、No.6〜11の6種の条件で単斜晶系に属すると思われる形状の結晶が得られた。この結晶をX線解析に供する予定である。
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