| 研究課題/領域番号 |
09044228
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
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| 研究分担者 |
外山 博英 山口大学, 農学部, 助手 (60240884)
右田 たい子 山口大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (90159161)
三芳 秀人 京都大学, 農学部, 助教授 (20190829)
山田 守 山口大学, 農学部, 助教授 (30174741)
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| キーワード | ピロロキノリンキノン / キノプロテイン脱水素酵素 / グルコース脱水素酵素 / アルコール脱水素酵素 / X線構造解析 / Pseudomonas putida / 大腸菌 / 酢酸菌 |
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| 研究概要 |
本研究は、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするキノプロテイン脱水素酵素である大腸菌のグルコース脱水素酵素(GDH)および酢酸菌やpseudomonasに存在する異なる3種類のアルコール脱水素酵素(ADH)の構造と機能を、生化学、有機化学、遺伝子工学及びX線構造解析の手法を総合的に駆使して解明することを目的としており、本年度は、以下に示す研究成果を得た。1)大腸菌GDHの構造機能解析:GDHの変異体をランダム変異法と部位特異的変異法を組み合わせて調製し、細胞膜から精製したそれら変異体のキネティクス解析を基に、PQQの周辺で酸化反応に関与する部位と分子内電子移動反応、さらにユビキノン結合部位に関与する部位について解析した。その結果、PQQからのプロトンの引き抜きにAsp466が、電子移動にはAsp730が関与することを推定した。2)Pseudomonas ADHの電子伝達反応の解析:Pseudomonas putidaのペリプラズムにADHとともに大量のブルー銅タンパク・アズリンが生成されることを見いだした。そこで、その銅タンパクをADHとともに分離・精製し、ADHとこのアズリンとの電子移動反応のキネテックス解析や蛍光変化を基にした結合解析を行った。その結果、両タンパク質はかなり速い速度で反応し、しかもその反応は両者の疎水結合をベースに進行するが、非常に速やかなon-off反応を行っていると推測した。3)酢酸菌ADH及びPseudomonas ADHのX線構造解析:P.PutidaのADHの結晶化は既に成功しているが、そのX線構造解析をさらに進めるとともに、酢酸菌の膜結合型ADHの結晶化に取り組み、その結晶化に成功し、現在その構造解析をはじめたところである。
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