| 研究概要 |
IAP欠損マウス作成のためのtargeting vectorは2.2kb left arm-pgkNeo cassette-1.1kb right arm-DTA cassetteの構造に作成した。1eft armはエクソン1からエクソン7までを含み、right armはエクソン8の一部からエクソン11の一部を含んでいる。1eft arm2.2kbは129Jマウスのゲノムライブラリーから分離したもので、right arml.1kbはBalb/c由来のDNA配列からプライマーを作り、D3ES細胞(129sv+/+マウス)ゲノムDNAをもとにPCR増幅し最後にDNA配列を確認したものである。ターゲッティングベクターを常套の方法に従ってD3ES細胞に遺伝子導入し、127個のG418耐性クローンを分離した。最初のスクリーニングとしては、BamHI処理のゲノムDNAを、right-arm probeをもちいてSouthern Blotにより検索し、5個のクローンを選んだ。これらのクローンについて、さらに、KpnI,EcoRI,Bg1Iで処理後、right-arm probeおよびNEO probeにより検討したところ、予想されるパターンを示したクローン#33が得られた。そこで、homolo-gous recombinationを確認するため、HindIII,KpnI,BamHI,Bg1I,NcoI処理のゲノムDNAについて、1eft-arm probeおよびexternal probeをもちい分析した結果homologous recombinantであると確認された。クローン#33は90%以上割合で染色体数が40であったので、blastocyst injectinを行った。現在、4匹に雄キメラを4匹ずつの雌C57Bl/6と交配中で、3匹の雌の妊娠が確認された段階である。メラを4匹ずつの雌C57Bl/6と交配中で、3匹の雌の妊娠が確認された段階である。
|
