嫌気呼吸系金属酵素の構造と機能

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09235203
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 祥雲 弘文 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70012036)
• 研究分担者: 高谷 直樹 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (50282322)
• キーワード: 脱窒 / Fusarium oxysporum / フラボヘモグロビン / 亜硝酸塩基還元酵素 / シトクロムP450nor / 一酸化窒素還元酵素

研究概要

1. 脱窒真菌Fusarium oxysporumの脱窒に一酸化窒素還元酵素として関与するシトクロムP450norのX線結晶構造解析に成功した。本P450の酸化型と基質NOとの複合体の性質について、赤外、共鳴ラマン、X線等の吸収スペクトルを観察、P450camのデータと比較することにより、その特異な結合を明かにした。
2. 脱窒真菌Cylindrocarpon tonkinenseより亜硝酸塩還元酵素を単離、精製した。本酵素は、カビから唯一単離されていたFusarium oxysporumの同酵素を同様に同含有型であると思われるが、その性質はかなり異なっていた。
3. F.oxysporumからフラボシトクロムを単離し、そのN末端アミノ酸配列からヘムドメインがヘモグロビンなどと相同性を持つことを明らかにした。すなわち本タンパク質はヘモグロビンとFADを含む還元酵素との融合タンパク質であると考えられる。結合するヘムはNADPHにより還元された。またシトクロムc還元活性も示すが、その活性がSODで阻害されることから、スーパーオキシドが生じていることが予想される。フラボヘモグロビンは他の生物からも幾つか見つかっているが、何れも生理機能は不明である。本菌の場合、脱窒条件で誘導されることから脱窒に関与することが予想される。
4. シトクロムP450norとイソチオシアネートの相互作用について分光学的解析を行い、その特異な性質を明らかにした。
5. シトクロムP450norのアミノ酸残基を、部位指定変位異などにより置換した様々な変異タンパク質を作成し、それらの性質を調べることにより反応機構の解明を行っている。とくにIヘリックス中に保存されるスレオニン残基 (T243)や、NADHの結合に関わると予想されるアルギニン残基(R64)、Bヘリックス中に存在するグリシン(G76)等に着目した解析を行っている。

研究成果

• [文献書誌] S.-Y.Park: "Crystal structure of nitric oxide reductase from denitrifying fungus Fusarium oxysporum" Nature Stuructural Biology. 4・10. 872-832 (1997)
• [文献書誌] E.Obayashi: "Unique binding of nitric oxide to ferric nitric oxide reductase from Fusarium oxysporum elucidated with infrared,resonance raman,and X-ray absorption spectroscopies." Journal of American Chemical Society. 119・33. 7807-7816 (1997)
• [文献書誌] S.-Y.Park: "Crystallization,preliminary diffraction and electron paramagnetic resonance studies of a single crystal of cytochrome P450nor." FEBS Letters. 412・2. 346-350 (1997)
• [文献書誌] Y.Imai: "Absorption spectral studies on heme ligand interactions of P-450nor." Biochimica Biophysica Acta. 1337・1. 66-74 (1997)
• [文献書誌] N.Okamoto: "Fungal P450nor:Expression in Escherichia coli and site-directed mutagenesis at the putative distal region." Archives Biochemistry and Biophysics. 337・2. 338-344 (1997)
• [文献書誌] U.P.Singh: "Effects of heme substitution on spectral and functional properties of cytochrome P450nor." Journal of Inorganic Biochemistry. 67・1-4. 104-104 (1997)