ノンヘム型の2価鉄イオンを含む-2原子酸素添加酵素の超高分解能X線結晶構造解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09235210
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
• 研究分担者: 千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• キーワード: ノンヘム鉄 / 2原子酸素添加酵素 / ジオキシゲナーゼ / X線解析 / 蛋白結晶学 / 蛋白精造 / ビフェニル分解代謝系 / PCB分解代謝系

研究概要

本研究では、活性中心の鉄イオンの周囲の電子密度(特に電子の局在化の様子)を1.2Å以上の高分解能で可視化する事を目的としている。本年度は、まず第一に高分解のX線回折像を与える良質の結晶の作成を、精製条件の再検討も含めて行った。具体的には精製段階においてイオン交換カラムの容量等、使用法を最適化することで、以前に比べて純度の高い蛋白質サンプルを得ることに成功した。更に、結晶化条件に関しても、より大粒の結晶を得るために、再検討を行った。その結果、現在までのHangind drop法からBatch法に変更することで、より大粒の結晶を得ることに成功した。以上に加え、高分解能回折データを測定するには、X線による結晶の損傷を最低限に押さえる必要がある。このためには、超低温での回折強度測定が効果的と考え、超低温(100K)での回折強度測定の為の条件検討を行った。その結果、BphC酵素の結果を30%のエチレングリコールを含む標準緩衝液(BphC酵素の結晶の保存溶液)に浸すことで、良好なデータ測定が可能なことを見出した。
また、活性型(活性中心の鉄イオンが2価の状態)での構造解析を行うためには、無酸素的に結晶化を行い、活性中心の鉄イオンの酸化を防ぐ必要がある。このために、高度に酸素を取り除いた状態で結晶化を行うための装置を設計し、これを作成した。

研究成果

• [文献書誌] Mitsui,Y. & Senda,T.: "Elucidation of the basic three-dimensional structure of Type I interferons and its functional and evolutionary implications." J.Interferon and Cytokine Res.17. 319-326 (1997)
• [文献書誌] Nandhagopal,N., Senda,T., Hatta,T., Yamada,A., Masai,E., Fukuda,M. & Mitsui,Y.: "Three-dimensional structure of microbial 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienole acid (HPDA) hydrolase (BphD enzyme) from Rhodococcus sp. stratin RHA I,in the PCB degradation pathway." Prot.Japan Acad.Series B. 73. 154-157 (1997)