内因性キロキナーゼ・フォスタファターゼ系によるP型ポンプの可逆的リン酸化とイオン輸送

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09257201
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 谷口 和弥 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204)
• 研究分担者: 島田 明 北海道大学, 大学院・理学研究科, 講師 (60001848) ; 今川 敏明 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (20142177) ; 嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90186023)
• キーワード: H^+,K^-ATPase / チロシンキナーゼ / セリンキナーゼ / カルシウム

研究概要

従来までの研究により、H,K-ATPaseのα鎖のTyr10とTyr7が順に、またSer27がH,K-ATPase標品(GI画分)に内在するチロシンおよびセリンキナーゼによってそれぞれリン酸化されることを見いだした。本研究ではα鎖をリン酸化する両キナーゼの性質をα鎖、およびα鎖のリン酸化部位をマルトース結合タンパク質(MBP)と融合させたリン酸化モデル基質(MBP-HK)を用いて検討し、さらに免疫反応から、その同定を試みた。
GI画分にCaを添加して内在性キナーゼによるリン酸化反応を行ったところ、Ca濃度に依存(K1/2=0.9μM)してα鎖のセリンリン酸化量が増加したが、チロシンリン酸化はCa濃度に依存しなかった。界面活性剤CHAPS存在下では、α鎖のセリンリン酸化量は減少し、Ca濃度依存性も消失したが、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤TPAを添加すると、Ca濃度に依存(K1/2=1.0μM)したリン酸化が観察された。CHAPS処理前後のα鎖、およびMBP-HKのセリンリン酸化は、PKC特異的阻害剤で阻害した。さらに、抗PKC抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果より、GI画分中にPKCαとPKCβIIが存在することが示され、両PKCともMBP-HKをリン酸化することが明らかになった。
一方、チロシンホスファターゼ阻害剤であるバナジン酸存在下で観察されるα鎖のチロシンリン酸化は、pp60src阻害剤ゲニステインで阻害された。抗c-Src抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果より、GI画分において分子量5万と6万のc-Src様プロテインキナーゼの存在を確認した。免疫沈降により得られた、免疫複合体を酵素源とするMBP-HKのチロシンリン酸化が観察された。CHAPSで可溶化したGI画分からこの2種のチロシンキナーゼをゲル濾過カラム(Superose12)で分離し、MBP-HKへのチロシンリン酸化能を検討したところ、分子量6万のキナーゼのみがα鎖N末端の配列をチロシンリン酸化することを見い出した。
本研究によって、GI画分に内在する膜型のPKCαとβIIがCaに依存して、また膜型のc-Src様チロシンキナーゼがそれぞれα鎖をリン酸化することが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] D.J.Kane: "Stopped-Flow Kinetic Invegtigation of Conformational changes of Pig Kidney Na^+,K^+-ATPase" Biochmigtry. Vol36,No.43. 13406-13420 (1997)
• [文献書誌] T.TSUDA: "Are phyidoxal and Fluorescein propeg.in Lysine Residues of α-chain in Na^+,K^+-ATPase gensing ATP Binding?" Ann.N.Y.Acad.Sci.834. 186-193 (1997)
• [文献書誌] J.P.FROEHLICH: "Complex kinetic Behavior in the Na,K-and Ca-ATPases" Ann.N.Y.Acad.Sci.834. 280-296 (1997)
• [文献書誌] K.TOGAWA: "Phosphorylation of Tyr^7,Tyr^<10>,and Ser^<27> of α-Chain in H^+,K^+-ATPase by intrinsic and Extrinsic kinases" Ann.N.Y.Acad.Sci.834. 582-584 (1997)
• [文献書誌] S.KAYA: "cloning of Eel Eloctroplax Na^+,K^+-ATPase α Subunit" Ann.N.Y.Acad.Sci.834. 129-131 (1997)
• [文献書誌] H.Eguchi: "ATP-Induced pynamic Fluorescence changes of a N-〔P-(2-Bentimidazolyl)pheny1〕maleimide probe at cys in the α-chain of pig stomach H^+,K^+-ATPase" J.Biochem. 122. 659-665 (1997)
• [文献書誌] T.TSUDA: "Fluorescein 5′-Isothiccyanate-Modified Na,K-ATPase,at Lys-501 of the d-Chain,Accepts ATP Independent of pyridoxal 5′-Diphosphe-5′-Adenosine Modification at Lys-480" J.Biochem. 123. 169-174 (1998)