Na^+/Cl^-依存性トランスポーターの分子間相互作用と機能協関する蛋白質の検索

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09257229
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 斎藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• 研究分担者: 白井 康仁 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (60263399) ; 酒井 規雄 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (70263407)
• キーワード: ナトリウム / クロライド / セロトニン / トランスポーター / リン酸化 / 脱リン酸化 / 変異体

研究概要

本研究では、Na^+/Cl^-依存性トランスポーターの一種であり、感情障害の原因とも考えられているセロトニントランスポーター(SET)に注目し、SETと結合し機能協関する蛋白質の検索と機能解析を目的とした。SETの生理機能を解析するために、まず、リン酸化、脱リン酸化によってSETの機能がどのように修飾されるかを検討した。SET活性は、PKCの活性化により有意に抑制され、その抑制はリン酸化酵素阻害薬によって完全に阻害された。また、不活性型のホルボールエステルはこのような抑制効果を示さなかった。また、フォスファターゼ1および2Aの阻害剤であるカリクリンAも同様にSET活性を抑制し、そのカリクリンによる抑制もリン酸化酵素阻害薬によって阻害された。これらの事実により、SET活性はリン酸化、脱リン酸化のバランスによって制御されていることが示された。Eadie-Hofstee解析により、このTPAやCLAによる制御はSETのセロトニンに対する親和性には影響を与えず、最大取り込み速度の抑制によることが示された。このプロテインキナーゼCによるリン酸化が、直接のリン酸化によるものであるかどうかを検討するために、site-directed mutagenesisを用いて、5カ所のリン酸化されうると推定されるそれぞれのセリンあるいはトレオニン残基を変異させた変異体を作製し、リン酸化、脱リン酸化の影響を検討した。その結果、すべてのリン酸化されうる部位を変異させても、TPA、CLAの効果が認められ、少なくともこの5カ所は直接リン酸化されないことが明らかになった。これらの結果から、SETはリン酸化・脱リン酸化酵素によって、間接的に制御されておいることが示唆された。今後、その間接的な制御機構を分子レベレで解明するためにSET結合蛋白の単離を行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Morikawa,O., 他: "Effects of interferon-α and -γ on the transcriptional regulation of serotonin transporter." Eur.J.Pharmacol.(印刷中).
• [文献書誌] Sakai N.他: "Modulation of serotonin transporter activity by a PKC activator and an inhibitor of type 1 and 2A serine/threonine phophatases." J.Neurochem.68. 2618-2624 (1997)
• [文献書誌] Sakai N.他: "Direct visualization of translocation of γ-subspecies of protein kinase C in living cells using fusion proteins with green fluorescent protein." J.Cell Biol.139. 1465-1476 (1997)
• [文献書誌] Nakashita M., 他: "Effects of tricyclic and tetracyclic antidepressants on the three subtypes of GABA transporter." Neurosci.Res.29. 87-91 (1997)
• [文献書誌] Nishimura M.他: "Differential expression patterns of GABA transporters(GAT1-3)in the rat olfactory bulb." Mol.Brain Res.45. 268-274 (1997)
• [文献書誌] Obata H.他: "GABAergic neurotransmission in rat taste buds ; Immunocytochemical study for GABA and GABA transporter subtypes." Mol.Brain Res.49. 29-36 (1997)