Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09257239
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 平田 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)
• キーワード: アミノ酸トランスポーター / 融合タンパク質 / 大量発現 / 好熱菌 / 超好熱菌 / 大腸菌

研究概要

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42.5kDaの単一ポリペプチドからなり、Na^+あるいはH^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるNa^+/H^+駆動型アミノ酸(アラニン、グリシン、セリン)トランスポーターである。昨年度までに、acp遺伝子を大腸菌内で発現させることによりN末端領域についての知見が得られ、さらに、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質の形で大量に発現させることが可能となった。本年度はさらに(1)結晶化を目標とした生理機能を有するACP精製タンパク質の大量発現系の構築、(2)ACP相同タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び輸送機能の解析、さらに(3)超好熱菌ゲノムライブラリーからの相同機能を有する遺伝子のクローニング及び機能発現などについて試みた。(1)については、これまでに大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)発現ベクター(pMALc2)にacp遺伝子を挿入し融合タンパク質MBP-ACPとして大量発現させるようなプラスミド(pAC6268)を構築し、大腸菌TB1株で発現させる系を確立したが、この大量発現した融合タンパク質の輸送比活性は本来のACPの1%以下と低かった。そこで大量発現によって生じた不溶性タンパク質のrenaturationに用いられている大腸菌シャペロニンGroEL/ES複合体遺伝子との共発現を試み、MBP-ACPを共発現するクローンが得られた。また、(2)については、大腸菌ゲノム計画により見いだされた配列の中にACPと相同性の高いORF476が存在していることが明らかとなっているので、このORF476がアラニン輸送体としての機能をもっているかを調べるために、この遺伝子のクローニングを行い輸送機能の解析を行ったところORF476もACPやA.DagAのホモログであることが明らかとなった。さらに(3)については超好熱菌Thermococcus KS-1のゲノムライブラリーから発現クローニング法によりグリシン輸送促進能を示す遺伝子ORF232が得られた。このDNA配列を解析したところ、5〜6回膜貫通領域と推定されるタンパク質をコードしており、このタンパク質が新規の中性アミノ酸トランスポーターありは促進因子であることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Jin,T.: "Selective Na^+ Transport through Phospholipid Bilayer Membrane by a Synthetic Calix[4]arene Carrier." Langmuir. 12. 2684-2689 (1996)
• [文献書誌] Kamata,H.: "Nerve Growth Factor and Forskolin prevent H202-induced Apoptosis in PC12 Cells by Glutathione independent Mechanism." Neurosci.Lett.212. 179-182 (1996)
• [文献書誌] Kamata,H.: "Involvement of cellular redox state in cell survival and neuronal differentiation in PC12 cells." Biochem.Soc.Trans.24. 541- (1996)
• [文献書誌] Kamata,H.: "Suppression of NGF-induced Neuronal Differentiation of PC12 Cells;N-Acetylcysteine(NAC)uncouples the Signal Transduction from Ras to the MAP Kinase Cascade." J.Biol.Chem.271. 33018-33025 (1996)
• [文献書誌] Asakura,S.: "Fibroblasts spread on immobilized fibrin monomer by mobilizing a β1-class integrin,together with a vitronectin receptor αvβ3 on their surface." J.Biol.Chem.272. 8824-8829 (1997)
• [文献書誌] Tanaka,C.: "Redox Regulation of Lipopolysaccharide(LPS)-Induced Interleukin-8(IL-8)Gene Expression Mediated by NFkB and AP-1 in Human Astrocytoma U373 Cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.232. 568-573 (1997)
• [文献書誌] Kawauchi,K: "A possible immunosuppressant,cycloprodigiosin hydrochloride,obtained from Pseudoalteromonas denitricans." Biochem.Biophys.Res.Commun.237. 543-547 (1997)
• [文献書誌] Yagisawa,H: "Replaeements of single basic amino acids in the pleckstrin homology domain of phospholipase C-δ1 alter the ligand binding,phospholipase actibity,and interaction with the plasma membrane." J.Biol.Chem.273. 417-424 (1998)