蛍光標識プロテインキナーゼCの遺伝子改変マウスの作製とその神経可塑性研究への応用

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09259223
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 斎藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• 研究分担者: 白井 康仁 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (60263399) ; 酒井 規雄 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (70263407)
• キーワード: プロテインキナーゼC / トランスロケーション / GFP / コンフォーカル顕微鏡 / 培養細胞 / ホルボールエステル / カルシウム / 変異体

研究概要

本研究は、長期増強、長期抑圧現象におけるプロテインキナーゼC(PKC)分子種の役割を明らかにすることを目的とし、PKC各分子種のトランスロケーション現象の解析を行い、活性化型PKCとリン酸化基質の空間的関係を形態学的に解析することを目的とした。本年度は神経系に多く存在するPKC分子種のうち、シナプス後部に存在するγ-分子種に焦点を当て研究を行った。γ-PKCにGFP融合した蛋白質を細胞に発現させ、コンフォーカル顕微鏡下でGFP蛍光を指標として種々の細胞外刺激によるPKCの細胞内動態を経時的に記録した。刺激後のGFP蛍光の局在は、免疫蛍光染色によるそれぞれのPKC分子種の局在と一致しており、また、Immunoblotによってもγ-PKC-GFPの分解産物が認められなかったことから、経時的に観察したGFP蛍光はPKC自体の動態をあらわすものと考えられた。また、酵素学的な解析によりγ-PKC-GFPもγ-PKCと同様の酵素学的特性を持つことが明らかとなり、GFPの融合によってもγ-PKCの特性には影響が少ないと考えられた。このGFP融合PKC分子種を用いて1)TPAによるtranslocationは比較的遅い時間経過で起こり、irreversibleであった、2)CaイオンによるtranslocationおよびG蛋白質結合型受容体の刺激によるtranslocationも20sec以内に細胞膜にtranslocationし、3min以内に元の状態に戻る速くreversibleなものであった。また、site-directed mutagenesisを用いた実験により、受容体の刺激によるtranslocationには、Caイオン、C2 domainは必須であるが、TPAによるtranslocationには、Caion,C2 domainは必須ではないことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Morikawa,O., 他: "Effects of interferon-α and -γ on the transcriptional regulation of serotonin transporter." Eur.J.Pharmacol.(印刷中).
• [文献書誌] Sakai,N., 他: "Modulation of serotonin transporter activity by a PKC activator and an inhibitor of type 1 and 2A serine/threonine phophatases." J.Neurochem.68. 2618-2624 (1997)
• [文献書誌] Sakai,N., 他: "Direct visualization of translocation of γ-subspecies of protein kinase C in living cells using fusion proteins with green fluorescent protein." J.Cell Biol.139. 1465-1476 (1997)
• [文献書誌] Nakashita,M., 他: "Effects of tricyclic and tetracyclic antidepressants on the three subtypes of GABA transporter." Neurosci.Res.29. 87-91 (1997)
• [文献書誌] Nishimura,M., 他: "Differential expression patterns of GABA transporters(GAT1-3)in the rat olfactory bulb." Mol.Brain Res.45. 268-274 (1997)
• [文献書誌] Obata,H., 他: "GABAergic neurotransmission in rat taste buds ; Immunocytochemical study for GABA and GABA transporter subtypes." Mol,Brain Res.49. 29-36 (1997)