カリウムイオン可視化によるカリウムチャネル機能評価とその応用

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09273239
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 堀尾 嘉幸 大阪大学, 医学部, 助教授 (30181530)
• キーワード: カリウム / 内向き整流カリウムチャネル / グリア細胞 / クラスタリング / ラミニン / ミュラー細胞 / 網膜 / spatial buffering

研究概要

内向き整流カリウムチャネルファミリーは細胞静止膜電位の形成と安定化、維持あるいは、カリウムの輸送をおこなっているとされている。このなかで申請者らのグループによってクローン化されたKir4.1/KAB-2は脳グリア細胞に発現していることがin situ hybridizationによって明らかとなった。そこでこのKir4.1の分布と機能を調べるために網膜の主要なグリア細胞であるミュラー細胞をもちいてさらに検討した。Kir4.1mRNAはミュラー細胞に発現していた。さらに、Kir4.1抗体を使うことによってチャネル蛋白質自体もミュラー細胞膜上に広く分布していること、Kir4.1は膜上ではパッチ状に集積(クラスタリング)して存在していることが判明した。このクラスタリングの機構を生化学的、細胞生物学的に検討したところ、網膜ミュラー細胞ではSAP97という3つのPDZドメイン、SH3領域、グアニル酸キナーゼ領域をその構造内に持っている細胞内蛋白質がKir4.1のC末端にあるSer-Asn-Valという配列に結合することによってKir4.1-SAP97のコンプレックスができ、さらにSAP97が互いに凝集することによって起きていることがHEK293T細胞を使った再構成実験によってわかった。また、ミュラー細胞のKir4.1の発現はミュラー細胞を培養化することによって消失すること、培養液にインスリンを添加しておくとKir4.1mRNAの発現がおこるが、Kir4.1は細胞質にとどまって膜上に発現しないこと、インスリン存在下にラミニンを作用させると機能を持ったKir4.1の膜上での発現がみられ、この際、Kir4.1は膜上でクラスタリングしていることを見い出した。即ち、ラミニンはKir4.1の細胞質から膜上へのトランスロケーションに働いていることが強く示唆された。Kir4.1の機能は神経細胞が興奮した際に細胞外に放出するK+を吸収し、さらにそのK+を別の部位へ放出するsaptial bufferingをおこなっているものと考えられた。この機能をカリウム蛍光試薬を用いて現在検討している。

研究成果

• [文献書誌] Yamada M, et al.: "Sulfonylurea receptor 2B and Kir6.1 form a sulfonilurea-sensitive but ATP-insensitive K+ channel." Journal of Physiology. 499. 715-720 (1997)
• [文献書誌] Horio Y, et al.: "Clustering and enhanced activity of an inwardly rectifying potassium channel,Kir4.1.by an anchoring protein,PSD-95/SAP 90 family." The Journal of Biological Chemistry. 272. 12885-12888 (1997)
• [文献書誌] Hibino H, et al.: "An ATP-dependent inwardly rectifying potassium channel,KAB-2 (Kir4.1),in cochlear stria vascularis of inner ear : its specific subcellular localization and correlation with the formation of endocochlear potential." The Journal of Neuroscience. 17. 4711-4721 (1997)
• [文献書誌] Isomoto S.et al: "Sur2 and Kcnj8 genes are tightly linked on the distal region of mouse chromosome." Mammalian Genome. 8. 790-791 (1997)
• [文献書誌] Ishii M, et al.: "Expression and clustered distribution of an inwardly rectifying potassium channel,KAB-2/Kir4.1,on mammalian retinal muler cell membrane : Their Regulation by insulin and laminin signals." The Journal of Neuroscience. 17. 7725-7735 (1997)
• [文献書誌] Tada Y, et al.: "Assignment of the glial inwardly rectifying potassium channel KAB-2/Kir4.1 (Kcnj10) gene to the distal region of mouse chromosome 1." Genomics. 45. 629-630 (1997)
• [文献書誌] Okuyama Y, et al.: "Properties of SUR2A/Kir6.2 ATP-sensitive K+ channels expressed in a mammalian cell line,HEK 293T cells." pfulers Archiv European Journal of Physiology. (in press). (1998)
• [文献書誌] Kim DH, et al.: "Molecular cloning and functional expression of a novel weak inward rectifier K+ channel with two pore domains predominantly expressed in heart." Circulation Research. (in press). (1998)