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我々は、イヌ腎臓上皮由来の培養極性細胞であるMDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞のトランスゴルジネットワーク(TGN)での蛋白質・脂質の選別と小胞への組み込みに関わるソーター蛋白質の同定とその選別メカニズムを、TGN由来の分泌小胞膜蛋白質VIP17の細胞内機能解明を中心に研究している。今年度は、(1)極性細胞というコンテクストの中で分子の種々の機能を生化学的に探るため、連鎖球菌の酵素感受性毒素Streptolysin O(SLO)を用いて形質膜を部分的に透過性にした「セミインタクト細胞系」を完成した。これを用い、イリマキノン(海綿の代謝産物)により引き起こされた細胞分裂時におけるゴルジ体の小胞・断片化->再集合を、L5187Y培養細胞質とATP再生系を用い再構成することができた。(2)多重蛍光顕微鏡解析装置を開発した。本装置により、光学顕微鏡下で培養細胞・セミインタクト細胞の形態変化・カルシウム濃度変化・膜電位変化・pH変化等とともに、「細胞内の局在」で生起するイベント(蛋白質相互作用、膜動過程など)を高空間分解能・高時間分解能で定量化し、イメージングできる。今年度は、蛍光標識短鎖セラミド(C5-DMB-セラミド)を用い、生細胞中のゴルジ体からの分泌小胞形成の定量的アッセイ法を確立した。
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