放射菌の二次代謝・形態分化の制御におけるA-ファクターレセプターの機能の解明

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09306005
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 堀之内 末治 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (80143410)
• キーワード: Streptomyces griseus / A-ファクター / レセプター蛋白 / 二次代謝 / 形態分化 / X線結晶構造解析

研究概要

A-ファクターは放線菌Streptomyces griseusにおいて、二次代謝・形態分化を制御するγ-ラクトン型の微生物ホルモンである。S.griseusの菌体内にはA-ファクターと共同して機能を発揮するレセプター蛋白(ArpA)が存在するが、ArpAは塩基配列から予想されるアミノ酸配列内にDNA結合モチーフをもち、実際にin vitroにおいて特異的DNA結合能があり、A-ファクターの添加によってその結合能が速やかに失われる。本研究は以下の2つ戦略によりA-ファクターによる制御機能を分子レベルで解明することを目指した。
1.ArpAのターゲット遺伝子の同定
S.griseus染色体DNAを超音波により約500bpの長さに切断し、各断片の両端にアダプターDNAを連結した。これと精製ArpA蛋白を混合し、アクリルアミドゲルで電気泳動した。すでに示されていたArpA-(500bp)DNA複合体の移動距離をもとに、ゲルからArpA-DNA複合体を回収し、アダプターDANに対するプライマーを用いて、PCRによりArpAが結合するDNA断片を増幅した。得られたDNA断片に対して同様の操作を2回繰り返すことによって、最終的にArpAに結合する2種のDAN断片を取得した。これらのArpA結合配列周辺のDNA断片を染色体DNAよりクローン化し、塩基配列を決定した。このようにしてArpAのターゲット遺伝子の候補となる遺伝子を複数同定することに成功した。
X線結晶構造解析による3次元構造の決定
組み替え大腸菌からのArpAの簡便な精製方法を確立した後、PEG滴下法によるArpA蛋白の結晶化条件を蛋白濃度、緩衝液組成、pH等について様々に検討した結果、X線結晶構造解析に十分適用できるArpA結晶の取得に成功した。今後は重元素置換を行った後、X線結晶構造解析を行い3次元構造を決定する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Hiroyasu Onaka: "A mutation at proline-115 in the A-factor receptor protein of Stereptomyces griseus abolishes DNA-bonding ability but not ligand-binding ability" J.Bacteriol.179. 2748-2757 (1997)
• [文献書誌] Alexander Lezhava: "Chromosomal deletions in Streptomyces griseus that remove the afsA locus" Mol.Gen.Genet.253. 478-483 (1997)
• [文献書誌] Noriko Ando: "A Stereptomyces griseus gene (sgaA) suppresses the growth disturbance caused by high osmolality and a high concentration of A-factor during early growth" Microbiology. 143. 2715-2723 (1997)
• [文献書誌] Hiroyasu Onaka: "DNA-binding activity of the A-factor receptor protein and its recognition DNA sequences" Mol.Microbiol.24. 991-1000 (1997)
• [文献書誌] Noriko Ando: "Involvement of AfsA in A-factor biosynthesis as a key enzyme" J.Antibiot.50. 847-852 (1997)
• [文献書誌] Hiroyasu Onaka: "Involvement of two A-factor receptor homologs in Streptomyces coelicolor A3 (2) in the regulation of secondary metabolism and morphogenesis" Mol.Microbiol.(in press). (1998)
• [文献書誌] Sueharu Horinouchi: "Dynamic Aspects of Natural Products Chemistry : Molecular Biological Approaches" U.Sankawa and K.Ogura (eds.) Kodansha and Harwood Academic Publishers,Tokyo and Amisterdam, 296 (1997)
• [文献書誌] Sueharu Horinouchi: "Cell-Cell Communication in Bacteria" G.M.Dunny and S.C.Winans (eds.) American Society for Microciology,Washington,D.C. (in press), (1998)