| 研究分担者 |
甲斐 藏 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (90115543)
佐藤 嘉兵 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20059778)
竹之内 信子 日本大学, 歯学部, 助手 (50246914)
浅野 正岳 日本大学, 歯学部, 助手 (10231896)
岩瀬 孝志 日本大学, 歯学部, 講師 (80125046)
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| 研究概要 |
マウスSCDNAにneomycine resistant geneをmouse SCのexon 6相当部に入れたtargeting geneを作成し,これをES cellにelectron poration法で導入した。この細胞をG418(150mg/ml)およびgenomic Southern blot analysisでhomologous recombinationを起こしているES cellを選び出し,ICRマウスから得た胚盤胞に導入し,キメラを作成した。これを交配して得たマウスにおけるSCの発現について検索を行なった。
Northern blot analysisおよびRT-PCRによる検索
得られたdisrupted mouseの肝および腸管からAGPC法を用いてRNAを調整し,おのおの20mgのRNAを泳動し,nylon membraneにtransferした後,マウスSCcDNAをprobeとしてNorthern blot analysisをおこなった。その結果,肝および腸管にSCの発現は認められなかった。
さらに,得られたmRNAを用いてRT-PCRでも発現を確認したが,Northern blot analysisと同様SCの発現は認められなかった。コントロールには正常マウスおよびキメラのRNAを用いた。
免疫組織学的検索
腸管および肝をフォルマリンで固定した後,薄切切片を作成した。切片は脱パラした後,0.1%H2O2加100%メタノールで10分処理した後,PBSにいれたまま,20分電子レンジで加熱した。標本を室温に戻したのち,10%正常ヤギ血清と30分反応させた後,ウサギ抗マウスSC抗体と1時間,反応後,PBSで洗浄した。続いて,HRP標識抗ウサギIg抗体と反応後,PBSで洗浄,DABにて発色した。その結果,コントロールの腸管や肝の胆管にSCの局在が認められるのに対して,得られたマウスの腸管や胆管にSCの局在は認められなかった。
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