天然並びに合成糖鎖化合物(ネオグリコ化合物)の生物活性の探索と臨床応用の開発

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09359001
• 研究機関: 国立がんセンター
• 研究代表者: 齋藤 政樹 国立がんセンター, 研究所・ウイルス部, 部長 (60012762)
• 研究分担者: 松田 和洋 国立がんセンター, 研究所・ウイルス部, 主任研究官 (80251502) ; 石井 睦 国立がんセンター, 研究所・ウイルス部, 室長 (20232225) ; 濱中 裕一郎 国立がんセンター, 研究所・ウイルス部, 主任研究官 (40189618) ; 堺 隆一 国立がんセンター, 研究所・ウイルス部, 室長 (40215603)
• キーワード: ガングリオシドGM3合成酵素 / シアル酸転移酵素遺伝子 / 5'-RACE法 / アミノCTH合成酵素 / ヒトLARGE遺伝子 / シアリルモチーフ / ガングリオシドGD3合成酵素 / ガングリオシドGM3糖鎖ポリマー

研究概要

平成11年度は、以下の諸点を明らかにした:(1)ヒト神経芽腫や骨髄性白血病細胞に対する分化誘導能や増殖抑制能等、種々の生物活性を発揮する酸性糖脂質ガングリオシドの合成系キーエンザイムであるガングリオシドGM3合成シアル酸転移酵素(SAT-1)の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングして、ゲノム全長を含むゲノミッククローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる。3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)様々な糖鎖を酵素的に自動合成するための糖鎖自動合成機作製のための部分プロジェクトとして、またGM3合成酵素蛋白の立体構造解明のため、可溶型酵素蛋白の産出プロジェクトを開始した。マルトース結合蛋白(MBP)との融合蛋白として大腸菌に作成させる発現ベクターpMAL-c2、pMAL-p2の2種類に、ヒトSAT-1cDNAの蛋白翻訳部分ORFを挿入して最適のコストラクトを考案した。pMAL-p2を基本としたベクターによって発現された融合蛋白がGM3合成活性を発揮することが判明した。pMAL-c2ベクターによって発現された蛋白には酵素活性が認められない。融合蛋白としてのサイズは同一なので、この発現蛋白を詳細に検索することによって、酵素活性発現の分子機構の一部が明らかになるものと示唆された。(4)北大理学部との協同研究の一環としてアクリルアミドを架橋剤としたガングリオシドGM3糖鎖ポリマーを作成することに成功し、その生物活性の検索を開始した。(5)ヒト白血病細胞分化誘導に関して、GM3合成酵素に対峙するアミノCTH(ネカラクト・トリアカシルセラミド)合成酵素(N-アセチルグルコサミン転移酵素の1種)のcDNAクローニングを進めた。Karolinska研究所のDr.Jan Dumanskiとの協同のもとに、ヒトLARGE遺伝子cDNAを発現ベクターに組み込み、発現蛋白にアミノCTHを合成するGlcNAc-Transferase活性が検出できるかどうかの検討を開始した。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda M., Saito M., et al.: "Characterization of antiviral activity of lactoferrin against hepatitis C virus infection in human cultured cells"Virus Res.. 66. 51-63 (2000)
• [文献書誌] Ishi, A., Saito M., et al.: "Molecular characterization of ganglioside GM3 synthetic sialyltransferase-1 (CMP-NeuAc : Gal β1-4Glc β1-1'Cer α2, 3-sialyltransferase) : Its expression characteristics and genomics structure in humans and mice"J. Biol. Chem.. (in press). (2000)
• [文献書誌] Nakamoto T., Sakai R., et al.: "CIZ, a zinc finger protein that interacts with p130(cas) and activates the expression of matrix metalloproteinases"Mol. Cell. Biol.. 20. 1649-1658 (2000)
• [文献書誌] Matsuda K., Saito M. et al.: "HIV Induction from Latently Infected Cells by Phosphoglycolipid Antigens of Mycoplasma fermentans"Infect. Immun.. (in press). (2000)
• [文献書誌] Honda H., Sakai R., et al.: "p130Cas, an assembling molecule of actin filaments, promotes cell movement cell migration, and cell spreading in fibroblasts"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 262. 25-30 (1999)
• [文献書誌] Nishida Y., Matsuda K., et al.: "Synthesis and absolute configuration of a novel aminoglycoglycerolipid, species-specific major immunodeterminant of Mycoplasma fermentans"Tetrahedron Lett.. 40. 2371-2374 (1999)
• [文献書誌] 石井睦、齋藤政樹: "日本生化学会編"基礎生化学実験法"第5巻脂質・糖質・複合糖質 第17-5章 ガングリオシド"東京化学同人. 350 (2000)