| 研究概要 |
本研究は、申請者らのグループで世界に先駆けて開発した全く新しい原理に基づくオープンサンドイッチ免疫測定法、すなわち「抗原の存在によって誘導される可変領域断片VH,VLの複合体形成現象」を利用したオープンサンドイッチ法の適用範囲を広げることを狙ったものである。以下にその研究の成果を示す。
抗ニワトリリゾチーム抗体HyHEL-10以外にも、抗原の添加によってVHとVLの複合体形成が誘導される可変領域Fvを持つ抗体が普遍的に存在するかどうかを明らかにするために、ハプテン抗原であるジコキシンとNPに対する抗ハプテン抗体および抗インスリン抗体などを生産するハイブリドーマ細胞のライブラリーから抽出したmRNAを材料としてVH,VLのcDNAライブラリーを作製し、検討した。その結果、抗ジコキシン抗体と抗NP抗体については、弱いながらも抗原依存的なVH,VLの結合が観測された。また、抗インスリン抗体については、6種類の内の2種類において抗原依存的なVH,VLの結合が見られた。以上の結果から、抗原の添加によってVHとVLの複合体形成が誘導される可変領域Fvを持つ抗体が普遍的に存在することが明らかとなった。
大腸菌由来のアルカリホスファターゼ(phoA)と種々の抗体可変領域VHとの融合蛋白質ならびに抗体可変領域VLの大腸菌での発現系の構築、これらの材料を用いたオープンサンドイッチ免疫測定系の構築を行なった。抗体HyHEL-10のVH、抗NP抗体のVHをそれぞれ用いて融合蛋白質を作製した。HyHEL-10-VH/phoAの融合蛋白質系では、抗原HELの1ng/1以上の濃度範囲で再現性良く測定できることがわかった。一方、抗NP抗体VH/phoA融合蛋白質系では、バックグラウンドが高く、抗原NPの数百ng/1以上の濃度範囲でのみ測定が可能であった。バックグランドが高かった原因として、可変領域VH、VL間の結合定数と、抗原NP.VH、VL3者間の結合定数との差が1桁であり、抗体HyHEL-10の場合の4桁と比較して、不十分であったことが考えられる。
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