| 研究概要 |
標記研究において平成9年度は、ラセミ型アミノ酸エステル基質に対してL一体優先の高活性・基質立体特異性(いわゆるエステラーゼ活性)を発現する両親媒性プラスチック酵素(人工抗体触媒)の創製研究に集中し、以下の研究を通じて両親媒性プラスチック酵素の創製及び活性・特異性評価を行った。すなわち、
(1)ラセミ型アミノ酸エステル基質として、ベンジルオキシカルボニル(Z)保護基を持つロイシンp-ニトロフェニルエステル(Z-LD-Leu-PNP)を合成し、L体基質(Z-L-Leu-PNP)に対する両親媒性プラスチック酵素の優先的エステラーゼ活性・基質立体特異性に注目した。
(2)両親媒性プラスチック酵素の反応キャビテイー形成用の鋳型として、Z-LD-Leu-PNP加水分解反応の遷移状態類似体であるラセミ型フェニル1-ベンジルオキシカルボニル-3-メチルペンチルフォスフォネート(LD-TSA)を合成し、プラスチック酵素の触媒活性部位モノマーであるメチルN-アクロイル-L-ヒスチジネート(L-Hisモノマー)とDMSO溶媒中で予め水素結合型L-TSA・L-Hisモノマー複合体を形成させ(L-TSAを優先した複合体形成がNMR解析により判明)、その後アクリツアミド、N-(3-トリメチルアミノプロピル)アクリルニトリル、4級アンモニ-ム型アクリルアミド及びN,N-エチレンビス(2-プロペンアミド)架橋剤を添加し、AIBNによるラジカル重合(60℃)及び酢酸エチル-メタノールによる鋳型・未反応物質の除去を経て、8.6%架橋の両親媒性プラスチック酵素を創製した。
(3)創製したプラスチック酵素は極めて高い水溶性を示し、10%DMSO水溶液(pH7.15,30℃)におけるZ-LD-Leu-PNPに対するエステラーゼ活性評価において、ミハエリスーメンテン定数10^4Km=2.2mol dm^<-3>,10^4k=6.5s^<-1>、k/k^<uncat>=13.4及び速度定数比L/D=12の優れたL体基質特異的酵素反応を呈示し、より適切な両親媒性プラスチック酵素の設計により優れた活性・基質立体特異性の発現が可能であることが判明した。
(4)創製した上記両親媒性プラスチック酵素の優れたZ-L-Leu-PNP基質特異性は、アミノ酸側鎖が異なるエステル基質(Z-LD-Ala(or Phe)-PNP)及びアシル保護基が異なる各種ロイシン基質(C_n-LD-Leu-PNP:C_nは各種鎖長を持つアシル保護基)に対する低いエステラーゼ活性からも評価された。
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