低分子プローブを用いた液胞型H^+-ATPaseの生理機能解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09460047
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 永井 和夫 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (00011974)
• 研究分担者: 禹 済泰 東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (20272693)
• キーワード: 生理活性物質 / 免疫調節 / 骨形成 / 破骨細胞 / 細胞傷害性T細胞 / 液胞型H^+-ATPase

研究概要

マウス細胞傷害性T細胞の、標的細胞殺傷作用の抑制効果を指標として天然物に由来する活性成分を探索した結果、生薬のひとつ詞子抽出物中に活性を認めた。活性区分を精製したところ、gallic acidおよびchebulagic acidであることが判明した。これらはともに細胞傷害性T細胞の傷害顆粒の放出を阻害することを明らかにしたが、当初の目的である液胞型H^+-ATPaseの阻害活性は示さなかった。
コンカナマイシンAを処理した細胞傷害性T細胞中の細胞傷害顆粒は、内部pHが正常時の約5.7から約6.8に上昇することをpH指示薬を用いた蛍光染色法ならびに免疫電子顕微鏡観察により明らかにした。またパ-フォリン、グランザイム等の細胞傷害因子を含むとされるコア部分の構造が弛緩し、その周辺に水泡状の構造が出現することを電子顕微鏡観察により確認した。細胞傷害顆粒を密度勾配遠心により分取し内部活性因子の消長を生理活性ならびにイムノブロッティング法を用いて解析したところ、パ-フォリンの分解ならびに活性低下を認め、その経時的な変化から細胞傷害顆粒の成立ならびに顆粒内因子の安定化についてのモデルを提唱した。
液胞型H^+-ATPaseのATP加水分解反応は阻害しないが、それと共役したH^+の移行を阻害することを明らかにしているプロディギオシン25-Cについて、破骨細胞にたいする効果を検討したところ、細胞内酸性顆粒の酸性化を抑制するとともに、骨吸収機能を顕著に阻害することが観察された。

研究成果

• [文献書誌] Kazuo Nagai et al.: "Characterization of a series of vacuolar type H+-ATPase in hibitors on CTL-mediated cytotoxicity" Immunol.Let.55. 139-144 (1997)
• [文献書誌] Takao Kataoka et al.: "Characterization of perforin-based and Fas-based CTL-mediated cytotoxicity by using low molecular probes" in K.Funatsu et al.(eds.) Animal Cell Technology : Basic & Applied Aspects. 8. 547-552 (1997)
• [文献書誌] Je-Tae Woo et al.: "Low molecular weight microbial metabolites that suppress bone resorption by inhibiting vacuolar type proton pump activity of osteoclasts" in K.Funatsu et al.(eds.) Animal Cell Technology : Basic & Applied Aspects. 8. 627-632 (1997)
• [文献書誌] Kazuo Nagai et al.: "Immunosuppressive effects of gallic acid and chebulagic acid on CTL-mediated cytotoxicity" Biol.Pharma.Bull.20. 1017-1019 (1997)
• [文献書誌] Takao Kataoka et al.: "Inactivation and proteolytic degradation of perforin wihin lytic granules upon neutralization of acidic pH" Immunology. 91. 493-500 (1997)
• [文献書誌] Je-Tae Woo et al.: "Prodigiosin 25-C and metacycloprodigiosin suppress the bone resorption by osteoclasts" Biosci.Biotech.Biochem.61. 400-402 (1997)