| 研究課題/領域番号 |
09460049
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
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| 研究分担者 |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助手 (70243087)
吉村 徹 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70182821)
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| キーワード | フルオロ酢酸デハロゲナーゼ / 2-ハロ酸デハロゲナーゼ / Asp105 / 結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
フルオロ酢酸デハロゲナーゼと2-ハロ酸デハロゲナーゼの構造と機能の関連を調べた。すなわち、基質アナログとの複合体や、エステル中間体を形成した段階で反応が止まる変異酵素のエステル中間体の構造などを解析するとともに、ハロアルカンデハロゲナーゼと対比することによって、これら2酵素がハロ酸に作用する分子機構を検討した。具体的には、フルオロ酢酸デハロゲナーゼの活性中心アスパラギン酸残基Asp105の役割を解明するために、質量分析法などを駆使して詳しくて調べた。反応には直接関与しないが分子認識の点で重要な基質カルボキシル基に着眼し、酵素との結合状態を解析した。基質アナログの酵素複合体の構造を調べ、ハロゲンの結合部位について検討した。酵素反応がエステル中間体の段階で停止する変異酵素を調製し、これを用いてエステル中間体の構造を調べるとともに、基質カルボキシル基と結合する部位の変化を解析した。各種pHあるいは各種温度で、反応の進行を抑制した条件下でハロ酸とインキュベートすることにより、酵素-ハロ酸複合体を調製した。カルボキシル基結合とハロゲンイオン受け取りに関与する部位の動態を質量分析法によって調べた。さらに、2-ハロ酸デハロゲナーゼのThr14、Arg41、Lys151、Tyr157、Ser175、Asn177、Asp180などの残基の機能を明らかにするため、酵素と基質の複合体の結晶構造解析を行った。2-クロロプロピオン酸アミドと酵素の複合体の結晶構造解析を行い、基質結合部位、ハロゲンの引き抜きに関与する部位、立体特異性を規定する部位を明らかにした。
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