| 研究概要 |
電気刺激により高率に活性化したブタ単為発生2倍体を用いて,ブタ初期胚の無血清培養系を確立するため,アミノ酸の影響について検討した。97,98年度の研究成果をふまえて,最初の48あるいは72時間は等浸透圧,その後は低浸透圧下で培養を行った。BSAに代わる高分子化合物は0.5mg/ml PVAを使用し,その結果,以下のことが明らかになった
1.BSAをPVAに置換すると,胚盤胞までの発生率は維持されるが,その後拡張胚盤胞への発生が著しく抑制される。必須(EA)ならびに非必須(NEA)アミノ酸の混合液(AA)を培養の初めから添加すると著しい4-細胞ブロックが誘起され,無添加より発生率が低い。
2.AAの添加時期を変えた結果,活性化後48時間までにAAを添加すると,胚盤胞への発生(22%)は著しく阻害されたが,48あるいは72時間以降にのみAAを添加すると,発生率(60%)とBSA(60%)に匹敵し,拡張胚盤胞の割合も変わらない。
3.EAとNEAについて2.と同様に検討した結果,48時間までにEAが存在すると,著しい発生率の低下が認められ,AA添加の時より発生率は低下する。NEAはBSAと同様に,胚盤胞への高い発生率を支持し,NEAの存在はEAの発生抑制作用を緩和する。
次に,2倍体単為発生胎子(25日齢)における,インプリント遺伝子の発現性を検討した結果,以下のことが明らかになった。
1.マウスやヒトで明らかになっている大部分のインプリント関連遺伝子の配列がブタにおいて不明なことから,PCR用プローブを検討した。その結果,p57KIP2,PEG1/MEST,SNRPN,H19の4つの遺伝子においてブタ正常胎子から増幅産物が得られた。
2.配列既知のIGF2,IGF2R,WT1ならびに上記の4つの遺伝子について,ノーザンハイブリダイゼーションと半定量的PCR法により,正常と単為発生胎子で発現性の比較を行ったところ,IGF2は単為発生で発現量が低く,p57KIP2では同等であった。
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