ルーメンプロトゾアの遺伝子発現コドンの解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09460130
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 小野寺 良次 宮崎大学, 農学部, 教授 (60040862)
• キーワード: ルーメンプロトゾア / Entodinium caudatum / cDNAライブラリー / チューブリン遺伝子 / コドンユーセジ / ユニバーサルコドン / テトラヒメナコドン / 免疫抗体プローブ

研究概要

本研究は、反芻家畜の栄養学の観点から、遺伝子組換えによりルーメンプロトゾア体タンパク質の宿主に対する栄養価を改善することを最終目標としている。しかし、Tetrahymenaなどのプロトゾアは、遺伝子発現に際し、終止コドンなどがユニバーサルコドンから逸脱していることが知られているので、ルーメンプロトゾアについても、まずコドンの使い方を知ることが重要となる。本研究では、ルーメンプロトゾアの遺伝子発現のコドンの使い方を調査することを目的として、平成11年度は、ルーメンプロトゾアEntodinium caudatumのmRNAからcDNAライブラリーを新に作成して、チューブリン遺伝子のスクリーニングを試みた。まず、E.caudatumから可溶性タンパク質を抽出し、それらに対する抗体を作成した。これを用いて、免疫(抗体)プローブ法によりE.caudatumのcDNAライブラリーからランダムにポジテイブプラークをスクリーニングした。その結果、これまでにポジテイブプラークが数十個確認できた。その電気泳動の結果に基づいて、1〜2kbのサイズの遺伝子を選択し、塩基配列を決定した結果、全長が1379bpの配列が確認された。この遺伝子(EC tub1)は、既知のチューブリン遺伝子と高い相同性をもつことが確認された。この遺伝子は、ユニバーサルコドンでもテトラヒメナコドンでもORFが確認できたので、ECtub1からは、E.caudatumの終止コドンがユニバーサルコドンを使っているのか、それともテトラヒメナコドンを使っているのかは、特定できなかった。ECtub1のORFは、他の生物のチューブリン遺伝子のアミノ酸配列と比較すると、5'上流側の配列がやや短かった。そこで、上記のcDNAライブラリーを鋳型とし、その遺伝子の一部とベクターの一部(T3)の配列をプライマーとしてPCRを行ったが、そのPCR産物は、E.coliからのアーティファクトと考えられた。

研究成果

• [文献書誌] 岩田由香、小野寺良次ほか7: "ルーメントプロトゾアEntodinium caudatumのチューブリン遺伝子のクローニング"原生動物学雑誌. 32. 74 (1999)
• [文献書誌] 池田太郎,小野寺良次ほか4: "ルーメンプロトゾアEntodinium caudatumのN-acetyl-β-D-glucosaminidaseの精製"原生動物学雑誌,. 32. 63 (1999)
• [文献書誌] 駒谷謙司,小野寺良次ほか4: "ルーメンプロトゾアEntodinium caudatumのキチナーゼ遺伝子のクローニング(II)"原生動物学雑誌. 31. 50 (1998)
• [文献書誌] S.C.P.Eschenlauer,R.Onoderaほか4.: "Phylogentic position and codon usage of two centrin genes from the rumen ciliate protozoon,Entodinium caudatum."FEMS Microbiol.Lett.. 166. 147-154 (1998)
• [文献書誌] 駒谷謙司、小野寺良次ほか4: "ルーメンプロトゾアEntodinium caudatumのキチナーゼ遺伝子のクローニング"原生動物学雑誌. 30. 30 (1997)
• [文献書誌] R.J.Wallace,R.Onoderaほか1: "The Rumen Microbial Ecosystem(2nd Edition)"Blackie Academic&Professional, London. 719 (1997)
• [文献書誌] R.Onodera,M.R.Aminほか1: "Rumen Microbes and Digestive Physiology in Ruminants"Japan Science Society Press,Tokyo and S.Karger,Basel. 259 (1997)