シグナル伝達から見た牛白血球粘着不全症(BLAD)の生体防御欠損機構の解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09460133
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 桑原 幹典 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (10002081)
• 研究分担者: 田島 誉士 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 講師 (90202168) ; 木村 和弘 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (30192561) ; 永幡 肇 酪農学園大学, 獣医学部, 教授 (10133571) ; 首藤 文栄 岩手大学, 農学部, 教授 (60001533) ; 稲波 修 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10193559)
• キーワード: 牛白血球粘着不全症 / BLAD / 好中球 / スーパーオキシド / シグナル伝達 / NADPHオキシダーゼ / リン酸化酵素 / 生体防御

研究概要

本研究はウシ白血球粘着不全症(BLAD)を中心としたウシ遺伝性白血球機能障害の情報伝達から見た解析と、それを通じて好中球の殺菌能として重要なNADPHオキシダーゼの活性化機構を明らかにすることを目的とした。本研究で明らかに出来た事として、次のようなものである。
第一に正常好中球のNADPHオキシダーゼ活性化と貧食機構に関してp38MAPキナーゼという、最近発見された新しいキナーゼの関与を明らかにした。
第二にBLADの好中球はlgGや補体受容体刺激による活性酸素生成能は著しく低下しているが、その情報伝達系にRKCが関係するNADPHオキシダーゼ活性化システムの寄与が大きくなることを明らかにした。
第三にBLADに正常ウシの骨髄の移植を試みたところ、28カ月にわたりCD18の好中球での発現が観察され、臨床的症状の改善が見られた。
第四にBLADの類似の好中球の活性酸素生成が欠損しているヒト慢性肉芽腫症(CGD)の細胞を用いた研究で、NADPHオキシダーゼコンポーネントであるp47phox発現ベクターを発現させることでNADPHオキシダーゼ活性を回復させる事に成功した。またこのp47phoxの部位特異的突然変異法を用いた詳細な研究で、p47phoxの11個のセリン残基のうち4つのセリン残基のリン酸化がNADPHオキシダーゼ活性化の引き金になることを明らかにした。
第五にこの様な血球細胞からの活性酸素は生体系では、新生児期のの様々な疾病、炎症、虚血時の傷害と深く結びついて考えられているが、その防護のために、活性酸素に曝された細胞をその後、Troloxやカテキンなどの抗酸化剤で処理することにより損傷が軽減出来ることを培養細胞系とスナネズミの脳虚血モデルで見いだした。
以上のようなNADPHオキシダーゼ活性化機構をBLADならびにCGDからの細胞を用いることで明らかにすることができた。また骨髄移植、欠損酵素のコンポーネントの発現、酸化傷害からの抗酸化剤による防護法など、将来への治療という点でも意義のある成果が上げられた。

研究成果

• [文献書誌] Kuwabara,M. et al: "The increased formation of alkali-labile sites by a spin-trapping agent alpha-phenyl-N-tert-butylnitrone in gamma-irradiated frozen aqueous solution of DNA" J Radiat Res. 38. 153-155 (1997)
• [文献書誌] Nagahata,H. et al: "Prevalence and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion deficiency(BLAD)in Holstein-Friesian cattle in Japan." J Vet Med Sci. 59(4). 233-238 (1997)
• [文献書誌] Nagahata,H. et al.: "Prevalence anPreFc receptor-mediated phagocytosis, superoxide production and calcium signalling of beta 2 integrin-deficient bovine neutrophils." Microbiol Immunol. 41(9). 747-750 (1997)
• [文献書誌] Nagahata,H. et al.: "Leukocyte emigration in normal calves and calves with leukocyte adhesion deficiency." J Vet Med Sci. 59(12). 1143-1147 (1997)
• [文献書誌] Johnson,J.L. et al.: "Activation of p47(PHOX), a cytosolic subunit of the leukocyte NADPH oxidase. Phosphorylation of ser-359 or ser-370 precedes phosphorylation at other sites and is required for activity." J Biol Chem. 273. 35147-35152 (1998)
• [文献書誌] Okada,F. et al.: "Inflammatory cell-mediated tumour progression and minisatellite mutation correlate with the decrease of antioxidative enzymes in murine fibrosarcoma cells" Br J Cancer. 79. 377-385 (1998)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "Oral administration of (-)catechin protects against ischemia- reperfusion-induced neuronal death in the gerbil" Free Radic Res. 29. 359-365 (1998)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "The leukocyte NADPH oxidase subunit p47PHOX : the role of the cysteine residues." Arch Biochem Biophys. 350. 36-40 (1998)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "Activation of the leukocyte NADPH oxidase by phorbol ester requires the phosphorylation of p47PHOX on serine 303 or 304." J Biol Chem. 273. 9539-9543 (1998)
• [文献書誌] Nagahata,H. et al.: "Bone marrow transplantation in a Holstein heifer with bovine leucocyte adhesion deficiency" Vet J. 156. 15-21 (1998)
• [文献書誌] Nagahata,H. et al.: "Survival of transfused CD18-positive granulocytes and their chemiluminescent response in a heifer with leukocyte adhesion deficiency." J Vet Med Sci. 60(2). 261-262 (1998)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "Attenuation of caspase-3-dependent apoptosis by trolox post-treatment of X-irradiated MOLT-4 cells" Int J Radiat Biol. (in press). (1999)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "Lipid peroxides and antioxidants in serum of neonatal calves." Am J Vet Res.(in press). (1999)
• [文献書誌] Inanami,O. et al.: "H2O2-induced activation of SAPK/JNK regulated by phosphatidylinositol 3-kinase in Chinese hamster V79 cells" Antiox Redox Signal. (in press). (1999)
• [文献書誌] Kuwabara,M. et al: "Modern Application of EPR/ESR : From Biophysics to Materials Science" An ESR study of superoxide generation in stimulated neutrophils from a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency(BLAD), 46-53 (1997)