| 研究概要 |
ヒトCHS原因遺伝子の全長cDNAのクローニング
データベースに公開された情報に基づき、クロンテックのMarathon cDNA ampffication Kitを用いてlong range PCRを行った。Leukemia(promyelocytic HL-60 cellline;ATCC♯CRL240)cDNA library 及びMelanoma(G361cell line;ATCC♯CRL1424)cDNA Mibraryをテンプレートとして上流より3kb,4kb,5kbのそれぞれお互いに重なり合う3種類のクローンを得た。これらはXhol,Kpnl,Notlでライゲーションにより全長cDNAとすることが可能。今後、EB virus vectorのpREP9にクローニングして、患者培養細胞にトランスフェクトすることにより細胞内の巨大顆粒が消失することを確認したい。またこのままでは遺伝子治療用のcDNAとしては長すぎるので、部分cDNAでも同様に表現型の改善がみられるかどうか、もし見られるようならどの長さまで短くすることが可能かを調べたい。またこの部分cDNAを用い、GST-fusion proteinを作成して、ファーウェスタン法によりこの蛋白と結合可能な蛋白の同定ができればと思っている。
ヒトCHS原因遺伝子のゲノム構造の解析
3'の非翻訳領域の部分でゲノム上PCR法で増幅可能なプライマーペア-をデザインし、これでBACMoraryをスクリーニングした。1つのクローンが得られたので、このBACを直接シークエンスする事によりエクソン-イントロン構造を解析中。
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