培養表皮シートを用いた表皮水疱症の遺伝子治療システム開発のための基礎研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09470192
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 清水 宏 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (00146672)
• 研究分担者: 西川 武二 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50051579) ; 天谷 雅行 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90212563) ; 田中 勝 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (40188339)
• キーワード: 表皮水疱症 / 遺伝子治療 / 培養表皮 / ラミニン5 / Vil型コラーゲン / 出生前診断 / 基底膜 / 表皮

研究概要

蛍光抗体法において、蛋白レベルでlaminin5を完全に欠如しており、ペミデスモゾームの低形成が明らかなHerlitz致死型に典型的な症例を選び出した。症例における遺伝子変異部位をPCB,Heleroduplex,direct sequencing方などを用いて同定した。この症例から得られた培養表皮細胞を実験に用い、正常遺伝子を導入し、遺伝子導入により正常タンパクが発現したことを確認した。
さらに患者から得られた小皮膚片より、まず低カルシウム状態での培養により表皮細胞を単層で効率よく培養増殖させた。充分な面積に増大させた後、培養条件を正常カルシウムにスイッチすることにより表皮細胞を角化、重層化させ培養表皮シートを作製した。同時に,一部の培養表皮細胞はSV40によりtransformさせ、不死化細胞株をクローニングし樹立させ基礎実験を遂行した。partial LAMB3 DNAをenzyme cutting,ligationによりfull lengthにconstructし、Full length DNAをタラシスフェクトした。その結果、ラミニン5の発現を確認することができた。

研究成果

• [文献書誌] Takizawa Y Shimizu H et al: "Novel mutations in the LAMB3 gene shared by the Japanese unrelared families with Herlith junctional epidermolysis buiiosa,and their application for prenatal testing" J Invest Dermatol. 110. 174-178 (1998)
• [文献書誌] Takizawa Y Shimizu H et al: "Maternal uniparental meroisodisomy in the LAMB3 region of chromosome 1 results in lethal junctional epidermolysis bullosa." J Invest Dermatol. 110. 828-831 (1998)
• [文献書誌] Shimizu H et al: "Successful prenatal exclusions of an unspecified subtypes of severe epidermolysis ballosa" Int J Dermatol. 37. 364-369 (1998)
• [文献書誌] Shimizu H et al: "The 97-KD linear IgA bullous dermatosis antigen is not expressed in a patient with generalized atrophic henigh epidermolysis bullosa with a novel homozygous G258X mutation in COL17A1" J Invest Dermatol. (in press).
• [文献書誌] Takizawa Y Shimizu H et al: "Novel premature termination coder mutations in the laminin 92-chain gene (LAMC2)in Herlitz junctional epidermolysis bullosa" J Invest Dermatol. (in press).
• [文献書誌] Takizawa Y Shimizu H et al: "Combination of a novel frameshift mutation(1929delCA)and a recarrent nansense mutation(W610X)of the LAMB3 gene in Japanese patient with Herlitz junctional epidermolysis bullosa" J Invest Dermatol. (in press).