| 研究課題/領域番号 |
09470208
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
武田 雅俊 大阪大学, 医学部, 教授 (00179649)
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| 研究分担者 |
竹田 潤二 大阪大学, 医学部, 教授 (50163407)
田中 稔久 大阪大学, 医学部, 助手 (10294068)
中村 祐 大阪大学, 医学部, 助手 (70291440)
工藤 喬 大阪大学, 医学部, 助手 (10273632)
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| キーワード | アルツハイマー病 / プレセニリン / 点突然変異 / ノックインマウス |
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| 研究概要 |
本年度は、大阪の家族性アルツハイマー病で見いだされた遺伝子変異を持つプレセニリン1(PS1)遺伝子を導入したノックインマウスの作成に着手した。129SVJマウスジェノミックライブラリー(Stratagene)をスクリーニングし、PS-1遺伝子のエクソン8を含む領域をクローニングした。Quick Change SITE DIRECTED MUTAGENESIS KIT(Stratagene)を用いて このクローンのエクソン8に遺伝子変異(1213T)を導入し、またES細胞選別時のセレクションマーカーとして34塩基からなるlox部位ではさまれたネオマイシン耐性遺伝子をイントロンに挿入した。こうして得られたターゲッティングベクターをエレクトポレーション法にてES細胞に導入した。1週間後にコロニーを回収し、ProteinaseK処理を行った後、染色体DNAを回収し、サザン法・PCR法にて相同組み換えを起こしているES細胞を選別した。このES細胞を用いてアグリゲーション法にてキメラマウス6匹を得、B6の雌と交配、生まれた仔のうちagoutiのものを選び、その尾の一部を切断した試料から染色体DNAを抽出してPCR法にて導入した変異が入っていることを確認した。今回、このF1を用いて予備的解析を行った。脳ホモジュネート中のAβ40とAβ42をELISAにて定量したが、対照マウスに比し、有意な変化は認められなかった。また、免疫組織学的に検討したが、アミロイドの沈着は認められなかった。更にイントロンに入っているネオマイシン耐性遺伝子の影響を除去するため、oocyteの段階からcreリコンビネース活性を有するマウス(CAG-cre transgenic mouse)の供与を受け、上で述べたマウスと交配を行いこの遺伝子の除去した。今後はこのマウスを用いて検討を進める予定である。
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