1997 年度実績報告書

血栓性素因の分子細胞生物学的解析と遺伝子治療の基礎的検討

研究課題

研究課題/領域番号	09470228
研究機関	名古屋大学
研究代表者	斎藤英彦名古屋大学, 医学部, 教授 (20153819)
研究分担者	唐渡雅行名古屋大学, 医学部, 医員小嶋哲人名古屋大学, 医学部, 助手 (40161913) 高松純樹名古屋大学, 医学部, 助教授 (80221365)
キーワード	血栓性素因 / プロテインC欠乏症 / 分泌異常 / AAV / プロテインS / 遺伝子治療
研究概要	特発性血栓症の基礎疾患・プロテインC(PC)欠乏症を起こすPCNagoya分子は、血中に分泌されないことが推測され、Pulse chase実験、免疫蛍光顕微鏡、電子顕微鏡ならびにCOOH末端欠失変異体PC分子の発現解析により、その遺伝子異常からプロテインC欠乏症に至る分子病態の解析を行った。その結果、Pulse chase実験では、PCNagoya分子は正常に翻訳されるもののほとんど分泌されず細胞内で分解されることが判明した。免疫蛍光顕微鏡ではPCNagoyaはERパターン、電顕観察でもER内膣の著明な拡大がみられ、その合成過程でのERからGolgiへの輸送障害の存在が示唆された。さらに、PCNagoya分子の分泌障害は異常アミノ酸の存在が原因ではなく、正常PC分子のCOOH末端構造が失われることがその分泌異常の原因であることが明らかとなった。一方、AAVによる遺伝子治療を現実していく上での課題として、1)大量培養と濃縮、2)野生株のアデノウイルスの使用、3)パッケージングラインがある。大量培養は多層式カルチャーフラスコの使用とCsCl濃度勾配法の確立により、2)は共同研究カンパニ-より供給をうけることにより解決できた。さらに、3)についても近く共同研究者により完成する見込みで、実用にむけてのインフラは整いつつある。プロテインS(PS)を組み込んだリコンビナントAAVについては、プラスミドの作成を終了した。昨年我々の作成したpAAV/PS1はプラスミドのトランスフェクションによる発現を認めなかったため、この1年間は本研究室独自のプラスミドの作成に時間を費やしてきた。基本はマーカー遺伝子を組み込んだユニバーサルなpAAv/Neo/^,pAAV/^/Neoの2つを作成し、さらに肝細胞での特異的発現を考えプロモーターをアルブミンプロモーターに変更した。今後これらのプラスミドを用いヒト肝細胞でのPSの発現を検討する予定である。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] T.Yamazaki, A.Katsumi, H.Saito, et al.: "Two Distinct Novel Splice Site Mutations in a Compound Heterozygous Patient with Protein S Deficiency." Thromb. Haemost.77. 14-20 (1997)
[文献書誌] T.Nakanishi, K.Kadomatsu, H.Saito, et al.: "Expression of syndecan-1 and -3 during embryogenesis of the central nervous system in relation to binding with midkine." J. Biochem.121. 197-205 (1997)
[文献書誌] H.Nagase, K.T.Kitazato, H.Saito, et al.: "Antithrombin III-independent effect of depolymerized holothurian glycosaminoglycan(DHG)on acute thromboembolism in mice." Thromb. Haemost.77. 399-402 (1997)
[文献書誌] S.Tsuzuki, A.Katsumi, H.Saito, et al.: "Morecular Cloning, Genomic Organization, Promoter Activity, and Tissue-Specific Expression of the Mouse Ryudocan Gene." J. Biochem.122. 17-24 (1997)
[文献書誌] H.Nagase, K.Enjoji, H.Saito, et al.: "Effect of depolymerized holothurian glycosaminoglycan(DHG)on tissue factor pathway inhibitor : in vitro and in vivo studies." Thromb. Haemost.78. 864-870 (1997)
[文献書誌] N.Emi, S.Kidoaki, H.Saito, et al.: "TGene Transfer Mediated by Polyarginine Requires a Formation of Big Carrier-Complex of DNA Aggregate." Biochem. Biophys. Res. Commn.231. 421-424 (1997)
[文献書誌] H. Saito,: "Megakaryocytic cell lines. In Bailliere's Clinical Haematology : Megakaryocytes and platelet disorders." Caen J. P. and Han Z-C. etits. Bailliere Tindall., 10 : 47-63 (1997)

1997 年度 実績報告書

血栓性素因の分子細胞生物学的解析と遺伝子治療の基礎的検討

研究代表者

斎藤 英彦 名古屋大学, 医学部, 教授 (20153819)

研究成果

[文献書誌] T.Yamazaki, A.Katsumi, H.Saito, et al.: "Two Distinct Novel Splice Site Mutations in a Compound Heterozygous Patient with Protein S Deficiency." Thromb. Haemost.77. 14-20 (1997)

[文献書誌] T.Nakanishi, K.Kadomatsu, H.Saito, et al.: "Expression of syndecan-1 and -3 during embryogenesis of the central nervous system in relation to binding with midkine." J. Biochem.121. 197-205 (1997)

[文献書誌] H.Nagase, K.T.Kitazato, H.Saito, et al.: "Antithrombin III-independent effect of depolymerized holothurian glycosaminoglycan(DHG)on acute thromboembolism in mice." Thromb. Haemost.77. 399-402 (1997)

[文献書誌] S.Tsuzuki, A.Katsumi, H.Saito, et al.: "Morecular Cloning, Genomic Organization, Promoter Activity, and Tissue-Specific Expression of the Mouse Ryudocan Gene." J. Biochem.122. 17-24 (1997)

[文献書誌] H.Nagase, K.Enjoji, H.Saito, et al.: "Effect of depolymerized holothurian glycosaminoglycan(DHG)on tissue factor pathway inhibitor : in vitro and in vivo studies." Thromb. Haemost.78. 864-870 (1997)

[文献書誌] N.Emi, S.Kidoaki, H.Saito, et al.: "TGene Transfer Mediated by Polyarginine Requires a Formation of Big Carrier-Complex of DNA Aggregate." Biochem. Biophys. Res. Commn.231. 421-424 (1997)

[文献書誌] H. Saito,: "Megakaryocytic cell lines. In Bailliere's Clinical Haematology : Megakaryocytes and platelet disorders." Caen J. P. and Han Z-C. etits. Bailliere Tindall., 10 : 47-63 (1997)

1997 年度実績報告書

斎藤英彦名古屋大学, 医学部, 教授 (20153819)