イソプレン鎖延長酵素の触媒機能発現機構

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480138
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 古山 種俊 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (20089808)
• キーワード: プレニルトランスフェラーゼ / プレニル鎖延長 / イソプレノイド / ファルネシル二リン酸 / ポリプレノール / ウンデカプレニル二リン酸 / 生合成 / 遺伝子クローニング

研究概要

1) ウンデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子のクローニングとZ型プレニル鎖延長酵素の保存配列の同定:Z型プレニル鎖延長酵素としては世界で初めての例として、Micrococcus luzteusB-P26のウシデカプレニル二リン酸(UPP)合成酵素遺伝子のクローン化に成功し、大腸菌細胞内での大量産生系の構築、大量精製法の確立を行い、結晶化に成功した。データベース検索を進めた結果、Z型プレニル鎖延長酵素はE型プレニル鎖延長酵素とは全く異なる保存領域を持つ、進化的に独立した遺伝子ファミリーを形成していることが分かった。同じファミリーに属する酵母やヒトの遺伝子2種の同定を進めている。
2) ヘプタプレニル二リン酸合成酵素のヘテロサブユニット構造と触媒機能発現機構解朋:2つの解離性成分(IとII)の会合によって発現されるヘプタプレニル二リン酸(HepPP)合成酵素の動的な触媒機能の発現機構を2つの成分の抗体を用いた免疫ブロッティング法と光親和性基質アナログによる標識実験によって追究した。最初にアリル性基質の疎水性アルキル部分と成分Iが結合し、これがMg^<++>の存在下で成分IIと触媒機能を有する会合体を形成して酵素反応が開始される過程が解明出来た。
3) ランダム変異導入によるプレニル鎖延長酵素の触媒部位の同定:Z型プレニル鎖延長酵素としてUPP合成酵素、ヘテロサブユニット会合によるE型中鎖プレニル二リン酸合成酵素としてHepPP合成酵素の各々の触媒部位の同定を、各酵素遺伝子にランダム変異を導入して変異型酵素のライブラリーを作製し、触媒機能が欠失した変異型酵素を選別することで行った。UPP合成酵素では保存領域IIのAsnやTrpが、HepPP合成酵素の成分Iでは領域B内のSerやC末端領域が触媒機能発現やアリル性基質の結合部位として重要な役割を担っていることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] K.Ogura: "Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation" Chem.Rev.98・4. 1263-1276 (1998)
• [文献書誌] N.Shimizu: "Molecular Cloning,Expression,and Characterization of the Genes Encoding the Two Essential Protein Components of Micrococcus luteus B-P 26 Hexaprenyl Diphosphate Synthase" J.Bacteriol.180・6. 1578-1581 (1998)
• [文献書誌] N.Shimizu: "Molecular Cloning,Expression and Purification of Undecaprenyl Diphosphate Synthase:No sequence similarity between E-and Z-prenyl diphosphate synthases" J.Biol.Chem.273・31. 19476-19481 (1998)
• [文献書誌] A.Koike-Takeshita: "Intersubunit Structure within the Heterodimers of Medium-Chain Prenyl Diphosphate Synthases.Formation of a hybrid-type heptaprenyl diphosphate synthase" J.Biochem.124・2. 790-797 (1998)
• [文献書誌] Y.-W.Zhang: "Two Subunits of Heptaprenyl Diphosphate Synthase of Bacillus subtilis Form a Catalytically Active Complex" Biochemistry. 37・38. 13411-13420 (1998)
• [文献書誌] M.Nagaki: "Substrate Specificity of Thermostable Farnesyl Diphosphate Synthase with Alkyl Group Homologs of Isopentenyl Diphosphate" Bioorg.Med.Chem.Lett.8・18. 2549-2554 (1998)
• [文献書誌] 古山種俊: "ポリプレニル二リン酸合成酵素の構造と機能-はじめて明らかにされたZ型プレニル鎖延長酵素の構造-" 生物工学会誌. 76・10. 422-426 (1998)
• [文献書誌] S.Ohnuma: "Recognition of Allylic Substrates in Sulfolobus acidocaldarius Geranylgeranyl Diphosphate Synthase:Analysis Using Mutated Enzymes and Artificial Allylic Substrates" J.Biochem.123・6. 1036-1040 (1998)
• [文献書誌] T.Koyama: "Isopentenyl Diphosphate Isomerase and Prenylransferases,Comprehensive Natural Product Chemistry,Vol.2" Elsevier Science Ltd.,Oxford,D.Barton and K.Nakanishi ed., 69-96 (1999)
• [文献書誌] T.Koyama: "Structure and Function of Polyisoprenoid Chain Elongation Enzymes Biochemical Principles and Mechanisms of Biosynthesis and Biodegradation of Polymers" Wiley-VCH,A.Steinbuchel ed., 308-315 (1998)