脳・腸管系新規プロテアーゼの系統的検索、生理的意義・構造機能相関の解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480153
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 高橋 健治 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (70011533)
• 研究分担者: 西井 亘 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (30287461) ; 小島 正樹 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (90277252) ; 井上 英史 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (20184765)
• キーワード: 膜結合性プロテアーゼ / セリンプロテアーゼ / ヘプシン / CAAX-モチーフ特異的プロテアーゼ / トリプシン / α-キモトリプシン / 基質特異性 / 金属プロテアーゼ

研究概要

1.ラット肝臓ミクロソーム由来の膜結合性セリンプロテアーゼについてサブユニット組成、部分アミノ酸配列を決定し、本酵素が、従来DNAレベルでその存在が予想されていたが、正常組織からは精製・同定が困難であったヘプシンと同一物であることを確証した。
2.新規に開発した高感度蛍光・活性測定法を用いて、ウシ脳より膜結合性のRASカルボキシル末端CAAX配列特異的プロテアーゼを部分精製し、諸性状を明らかにした。この結果、本酵素が複数のサブユニットから構成されることが示唆された。
3.トリプシンおよびα-キモトリプシンのペプチド結合切断特異性が高アルカリ性pHでは制限されること、すなわち、トリプシンはArg-X結合にのみ作用し、Lys-X結合には作用しなくなること、またα-キモトリプシンはTyr-X、Phe-X結合のうち、後者にのみ作用するようになることを示した。
4.ブタ脳の膜画分より、プロガストリンC末ペプチド(88-101)を基質に用い、新規な金属酵素を精製し、諸性状を検索した。その結果、本酵素は分子量的76000の単量体で活性発現に0.001%以上の界面活性剤を必要とし、プロガストリンC末ペプチド以外にはBAH-12Pとブラジキニンにかなり特異的に作用すること、3×10^<-7>Mの低濃度EDTAで完全に阻害されること、またこの活性はZn^<2+>、Co^<2+>またはMn^<2+>イオンにより完全に回復しうることなどが明らかとなり、ユニークな膜結合性金属酵素であることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Hee-Jung Kim: "Purification and Characterization of an Extracellular Metalloprotease from Psevdomonas fluorescens" Journal of Biochemistry. 121. 82-88 (1997)
• [文献書誌] Kenji Takahashi: "The Specificity of Peptide Bond Cleavage of Acid ProteinaseA from Aspergillus niger var macrosporustoward Oxidized RibomucleaseA" Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 61. 381-383 (1997)
• [文献書誌] Kenji Takahashi: "Restriction of the Specificities of Trypsin and α-Chymotrypsin at a High Alkaline pH Value" Protein and Peptide Letters. 4. 33-38 (1997)
• [文献書誌] Hidemi Matsuzaki: "Evidence for the Identity of Rat Liver Microsomal Memb rane-Bound Serine Proteinase with Hepsin" Protein and Peptide Letters. 4. 55-62 (1997)
• [文献書誌] Wataru Nishii: "Partial Purification and Characterization of a CAAX-Motif-Specific Protease from Bovine Brain Using a Novel Fluorometric Assay" Journal of Biochemistry. 122. 402-408 (1997)
• [文献書誌] Kenji Takahashi: "Nitroguanidination of the Amino Groups of RibonucleaseT_1 with N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanideine" Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 61. 1601-1602 (1997)