タンパク質の分断による構造 機能ユニットの検索

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480154
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
• キーワード: トリプトファン合成酵素 / 構造ユニット / 分断酵素 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / TIMバレル

研究概要

遺伝子工学手法を用いてタンパク質を分断し、その中から活性を保持している分断酵素を探索することによって、分断可能な部位を定め、タンパク質の機能および構造の単位を推論しようという研究を展開した。特に、一次配列上ランダムに切れ目を入れて立体構造の構成単位を探ることを目的として研究を開始した。このため、昨年までに酵素タンパク質をコードしている遺伝子上の任意の位置に停止コドン、開始コドンからなるリンカーを挿入する方法を開発した。大腸菌のトリプトファン合成酵素をモデル酵素タンパク質として、分断化ライブラリーを作成し、トリプトファンを欠く培地から選択することによって、酵素活性を保持している分断化酵素が取得できるようになった。今年度は多くの変異体を取得することに成功した。こうして、TIMバレル型の立体構造を持つトリプトファン合成酵素は多くの切断可能な部位を持つことが明らかとなった。得られた分断酵素の多くは二つのフラグメントが重複した部分を含んでおり、古典的なプロテアーゼを用いたニックを入れた酵素の場合とは異なる結果となった。切断点はループ部分に多く、これは予想されたとおりである。分断化酵素の精製も試みているが、成功には至っていない。一方、高度好熱菌のイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデルとして、そのドメイン構造を指標として、遺伝子に切れ目を入れることから分断酵素の調製を試みているが、発現産物が不安定なためか切断ペプチドが得られていない。なお、条件を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] A.CHIBA et al.: "Coenzyme Activity of NAD Analogs for 3-Isopropylmalate Dehydrogenase from Thermus thermophilus HB8"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 63(9). 1647-1649 (1999)
• [文献書誌] J.Nathaniel et al.: "Structural Conservation of the Isolated Zinc Site in Archaeal Zinc-containing Ferredoxins as Revealed by X-ray Absorption Spectroscopic Analysis and Its Evolutionary Implications"J.Biol.Chem.. 274(33). 23160-23168 (1999)
• [文献書誌] S.AKANUMA et al.: "Further Improvement of the Thermal Stability of a Partially Stabilized Bacillus subtilis 3-Isopropylmalate Dehydrogenase Variant by Random and Site-Directed Mutagenesis"Eur.J.Biochem.. 260. 499-504 (1999)
• [文献書誌] M.NISHIHARA et al.: "sn-Glyceol-1-Phosphate-Forming Activities in Archaea:Separation of Archaeal Phospholipid Biosynthesis and Glycerol Catabolism by Glycerophosphate Enantiomers"J.Bacteriol.. 181[4]. 1330-1333 (1999)
• [文献書誌] C.MOTONO et al.: "Urea-Induced Unfolding and Conformational Stability of 3N-Isopropylmalate Dehydrogenase from the Thermophile Thermus thermophilus and Its Mesophilic counterpart from escherichia coli"Biochemistry. 38{4}. 1332-1337 (1999)
• [文献書誌] T.IWASAKI et al.: "in "Flavins and Flavoproteins 1999""Rudolf Weber,Berlin. 7 (1999)