フリーラジカルを生成する金属フラビン酵素の構造と機能

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480167
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 西野 武士 日本医科大学, 医学部, 教授 (40094312)
• 研究分担者: 岩崎 俊雄 日本医科大学, 医学部, 助手 (40277497) ; 岡本 研 日本医科大学, 医学部, 助手 (60267143) ; 堀 弘幸 日本医科大学, 医学部, 助手 (20256960) ; 永原 則之 日本医科大学, 医学部, 助教授 (10208043)
• キーワード: NO合成酵素 / キサンチン酸化酵素 / フリーラジカル / 金属フラビン酵素 / 非ヘム鉄 / EPR / セロビオース脱水素酵素 / X線結晶解析

研究概要

NO合成酵素およびキサンチン酸化酵素はフリーラジカルを生成する複合金属フラビン酵素である。NO合成酵素につき、大腸菌による発現系を用い、現在全酵素(野性型および数種の変異型)およびヘムドメインの発現酵素を発現させ、各種分光学的解析を用い解析を進めた。H4B非存在下で精製した酵素の超遠心分析によれば、大腸菌で発現したものは不活性の1量体型であり、H4Bによって始めて2量体を形成することが明かになった。しかし、2量体の形成は精製後は部分的であり、1量体型が何らかの変成型に容易に変化し、2量体を形成しないことを想像させた。種々の変異酵素につき物理化学的性質の解析を開始し、ヘム結合周囲の構造機能相関につき理解を進めた。また天然に存在が知られる変異酵素を大腸菌による発現系により発現させ、その性質の検討を行った。また、脂質による阻害を見い出しその作用部位と作用様式を蛋白化学的、反応速度論的に検討した。キサンチン酸化酵素に引き続き、脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。その分解能は2.3Åを示し、良好なnativeデータ収集が得られた。解析は現在進行中である。またcDNA発現系を用いて、脱水素酵素型から酸化酵素型への変換に関与するSH基の解析同定を行った。また2つの非ヘム鉄について前年度に部位特異的変異法により作成した酵素を用いてそれぞれの同定に成功した。本年度はさらにFeSIに配位しているシステイン毎に変異を与え、鉄に対する影響をEPRおよび酸化還元電位測定により調べた結果、FeSIの2つの鉄が同一の性質を示さないことが知られた。また複合金属フラビン酵素であるセロビオース脱水素酵素につきHumicola insolensから精製した酵素のフラビンドメイン、ヘムドメインを分離しそれぞれを解析した。

研究成果

• [文献書誌] Ichida K.Kamatani N.Nishino T.Saji M.Okabe H.Hosoya T.: "Mutations in xanthine dehydrogenase gene in subjects with hereditary xanthinuria" Adv.Exp.Med.Biol.431. 327-330 (1998)
• [文献書誌] N.Nagahara, Ito T.Kitamura H.and T.Nishino: "Tissue and subcellular distribusion of mercaptopyruvate sulfur transferase in rat" Histochem.Cell Biol.10. 243-250 (1998)
• [文献書誌] Otsubo, Y., Hori, H., Nishino, T.and Araki, T.: "Comparison of nitric oxide synthase in normal human placenta from 37 to 41 weeks gestation" J.Maternal-fetal Inves.8. 139-144 (1998)
• [文献書誌] K.Igarashi, M.Verhagen, M.Samejima, M.Schulein, K.L.Eriksson and T.Nishino: "Cellobiose dehydrogenase from the fungi Phanerochaete chrysoporium and Humicola insolens" J.Biol.Chem.274. 3338-3344 (1999)
• [文献書誌] K.Ichimori, M.Fukahon, H.Nakazawa, K.Okamoto and T.Nishino: "Inhibition of xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide" J.Biol.Chem.274. 7763-7768 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki, H.Hori,Y.Hayashi, T.Nishino: "Modulation of the remote heme site geometry of recombinant mouse neuronal nitric oxide synthase by the N-terminal hook region" J.Biol.Chem.274 in press.
• [文献書誌] T.Iwasaki, H.Hori, Y.Hayashi, T.Nishino, K.Tamura, S.Oogami, T.Iizuka, T.Ogura and H.Esumi: "Characterization of nNOS, a natural valiant of neuronal nitric oxide synthase constitutively produced in mouse brain by selective alternative splicing" J.Biol.Chem.274 in press.