フリーラジカルを生成する金属フラビン酵素の構造と機能

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480167
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 西野 武士 日本医科大学, 医学部, 教授 (40094312)
• 研究分担者: 堀 弘幸 日本医科大学, 医学部, 助手 (20256960) ; 岩崎 俊雄 日本医科大学, 医学部, 講師 (40277497) ; 永原 則之 日本医科大学, 医学部, 助教授 (10208043) ; 岡本 研 日本医科大学, 医学部, 助手 (60267143)
• キーワード: NO合成酵素 / キサンチン酸化酵素 / 金属フラビン酵素 / セロビオース脱水素酵素 / 電子スピン共鳴 / 非ヘム鉄 / X線結晶構造 / 活性酸素

研究概要

NO合成酵素およびキサンチン酸化酵素はともに分子量30万前後の2量体蛋白質であり、複数の反応中心をもつ複合金属フラビン酵素である。本研究ではこれらの複合金属酵素に加えセロビオース脱水素酵素(ヘムフラビン酵素)、およびラット由来ヘム結合蛋白質(HBP23)につきその構造と機能の解析を課題とした。研究経過とその成果は以下のとおりである。NO合成酵素:NO合成酵素ヘム結合ドメインはシトクロムP450と分光学的に類似していることが示唆されていたが、NO生産の場であるヘム中心の微細環境については十分解明されていなかった。可視、電子スピン共鳴、X線吸収スペクトル法により、基質非結合型、アルギニン結合型、ヒドロキシアルギニン結合型、銅イオン阻害型マウスnNOSホロ酵素の酸化型ヘム微細環境の構造変化を解析した。NO合成酵素活性に影響を与える諸因子について検討を加えた。特に脂質の結合部位とその阻害機構を検討した。キサンチン酸化酵素:すでに作成してあるキサンチン酸化酵素に引き続き、脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。立体構造が2.1Åまでのデータセットを基に構造が解かれた。詳細は現在論文執筆中である。脱水素酵素型の立体構造をもとにキサンチン酸化酵素の立体構造もMR法により2.5Å分解能でとかれた。フラビン周囲の構造はNADが近付き難い構造が酸化酵素ではみられいままでの推測を裏付けた。さらに二つの酵素型でセミキノンの安定性を説明できる周囲環境の差異が見られた。またcDNA発現系を用いて、脱水素酵素型から酸化酵素型への変換に関与するSH基の解析同定を行った。また2つの非ヘム鉄についてEPR、酸化還元電位および一次構造モチーフ上それぞれ異なる2つのタイプ(FeS I,FeS II)が知られているが、部位特異的変異法により作成した酵素を用いてそれぞれの同定に成功した。

研究成果

• [文献書誌] H.Hori,T.Iwasaki,Y.Kurahashi, and T.Nishino: "Calcium Dependent Inactivation of Neuronal Nitric Oxide Synthase: Evidence for the Existence of Stabilization/Activation Factor."Biochem. Biophys. Res. Commun.. 234. 476-480 (1997)
• [文献書誌] T.Nishino and T.Nishino: "Conversion of the dehydrogenase type to the oxidase type of rat liver xanthine dehydrogenase by midification of cysteine residues with fluorodinitrobenzene."J. Biol. Chem.. 272. 29859-29864 (1997)
• [文献書誌] K.Igarashi,M.Verhagen,M.Samejima,M.Schulein,K.L.Eriksson and T.Nishino: "Cellobiose dehydrogenase from the fungi Phanerochaete chrysoporium and Humicola insolens; A flavoprotein from Humicola insolens contains 6-hydroxy-FAD as the dominant active cofactor."J. Biol. Chem.. 274. 3338-3344 (1999)
• [文献書誌] K.Ichimori,M.Fukahori,H.Nakazawa,K.Okamoto and T.Nishino: "Inhibition of xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide; nitric oxide converts reduced xanthine oxidizing enzymes into the desulfo-type inactive form."J. Biol. Chem.. 274. 7763-7768 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishio,: "Modulation of the remote heme site geometry of recombinant mouse neuronal nitric oxide synthase by the N-terminal hook region."J. Biol. Chem.. 274. 7705-7713 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishino,K.Tamura,S.Oogami,T.Iizuka,T.Ogura and H.Esumi: "Characterization of mouse nNOS2, a natural variant of neuronal nitric-oxide synthase produced in the central nervous system by selective altemative splicing."J. Biol. Chem.. 274. 17559-17566 (1999)
• [文献書誌] S.Hirotsu,Y.Abe,S.Iwahashi,H.Hori,T.Nishino,K.Okada, and T.Hakoshima: "Crystallographic characterization of a stress-induced multifunctional protein, rat HBP23""J. Struct. Biol.. 126. 80-83 (1999)
• [文献書誌] S.Hirotsu,Y.Abe,K.Okada,N.Nagahara,H.Hori,T.Nishino, and T.Hakoshima: "Crystal strucure of a multifunctional 2-Cys peroxiredoxin, HBP23/PAG"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96. 12333-12338 (1999)