NMRおよびX線結晶構造解析併用による平滑筋ミオシンの構造機能連関の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480172
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 田之倉 優 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (60136786)
• 研究分担者: 佐々木 宏 大分医科大学, 医学部, 助手 (80272467) ; 西山 真 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教授 (00208240)
• キーワード: ミオシン / 平滑筋 / モータータンパク質 / NMR / 核磁気共鳴

研究概要

ミオシンはアクチンとともに筋肉の収縮装置を構成し、そのATPase活性は筋肉においてATPの化学的エネルギーを力学的エネルギーへ変換する過程において主要な役割を果たしている。本研究では、分子間相互作用及び分子のミクロ環境の良いプローブである核磁気共鳴(NMR)、精密3次元構造解析が可能であるX線結晶構造解析、ならびにその他の分光法、生化学的手法、蛋白工学的手法を用いて、骨格筋および平滑筋ミオシン、キネシン、およびncdの3次元構造ならびにATPase反応中間体の高次構造について明らかにし、それによってミオシンにおける化学エネルギーから力学エネルギーへの変換の機序を原子レベルで詳細に明らかにすることを目的として研究を行った。
ミオシン頭部S1とADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性から、平滑筋ミオシンS1についても、S1・ADP複合体の^<31>PNMRスペクトルが観測できることが明らかとなった。測定の結果、平滑筋ミオシン頭部とADPとの相互作用は、骨格筋ミオシン頭部とADPに比べて相互作用が強く、ADPの^<31>PNMRシグナルのブロードニングが激しいと考えられた。また、ncdおよびキネシンのモータードメインとADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度及びpH依存性を観測した結果、骨格筋および平滑筋S1と同じように低温で2種類のコンフォメーションが存在することが明らかとなった。さらに詳細な研究を行うため、昆虫細胞を使って平滑筋ミオシン頭部を発現するための発現系を構築し、タンパク質試料を得ることに成功した。また、ncdのATPase活性に及ぼすネック領域の効果についても明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Suzuki, Y., Ohkura, R., Sugiura, S., Yasuda, R., Kinoshita, K., Tanokura, M. and Sutoh, K.: "Modulation of actin filament sliding by mutations of the SH2 cysteine in Dictyostelium myosin II."Biochem. Biophys. Res. Commun.. 234(3). 701-706 (1997)
• [文献書誌] Suzuki, Y., Shimizu, T., Morii, H. and Tanokura, M.: "Hydrolysisi of AMPPNP by the motor domain of ncd,a kinesin-related protein."FEBS Lett.. 409(1). 29-32 (1997)
• [文献書誌] Suzuki, Y., Tanokura, M. and Shimizu, T.: "Evidence for existence of multiple conformations of kinesin and ncd motor domains in solution revealed by P^<31>NMR of the tightly bound ADP."Eur. J. Biochem.. 257(2). 466-471 (1998)
• [文献書誌] Tanokura, M. and Shimizu, T.: "A phosphorus-31 unclear magnetic resonance study on the complex of chichen gizzard myosin subfragment 1 with adenosine diphosphate."Mol. Cell. Biochem.. 190(1,2). 75-78 (1999)
• [文献書誌] Iwasaki, W., Sasaki, H., Nakamura, A., Kohama, K. and Tanokura, M.: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a 40kDa calcium binding protein specifically expressed in plasmodia of physarum polycephalum."J. Biochem.. 126(1). 7-9 (1999)
• [文献書誌] Taka, H., Kaga, N., Fujimura, T., Mineki, R., Imaizumi, M., Suzuki, Y., Suzuki, R., Tanokura, M., Shindo, N. and Muraayama, K.: "Rapid determination of parvalbumin from Ranecatesbeiana(Pi4.78)by combination of ESI mass spectrometry,protein sequencing and amino acid analysis."J. Biochem.. (in press.). (1999)