1999 年度実績報告書

II^4-ATP合成酵素の溶液および固体多次元NMRによる構造・機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	09480173
研究機関	横浜国立大学
研究代表者	阿久津秀雄横浜国立大学, 工学部, 教授 (60029965)
研究分担者	小澤潔横浜国立大学, 工学部, 助手 (20251770) 藤原敏道横浜国立大学, 工学部, 助教授 (20242381)
キーワード	H^+-ATP合成酵素 / F_1-ATPase / NMR / 固体NMR / H^+-ATP合成酵素βサブユニット / H^+-ATP合成酵素Cサブユニット / 化学合成
研究概要	昨年度までに明らかにしてきたβサブユニットの構造変化をさらに詳しく解析することを目指した。βサブユニットは分子量が5万であるため、NMRシグナルをブロードにしてしまう。そこで、緩和速度をおさえてシグナルをシャープにするためにタンパク質全体の重水素化を行った。まず重水中での大腸菌の培養条件の検討を行い、80%重水を含むM9培地中で大腸菌の培養に成功した。またIPTGで誘導をかけることによリタンパク発現も認められた。この重水素化βサブユニットを^<15>N標識し、2次元HSQCスペクトルを測定した。その結果、アミド領域のプロトンシグナルが^<15>Nによって分離して観測された。またTROSYを測定することによって8割程度のアミドプロトンが分離して観測された。大腸菌で大量発現させたsubunit cの精製法を検計し、精製された試料をSDS-PAGE、質量分析で確認したところ理論値と一致した。よって、大腸菌で大量発現させたsubunit cの合成方法、精製方法を確立することができた。また、この発現系を用いて、^<15>N-Gly subunit cを合成する事が出来た。したがって、アミノ酸ラベルsubunit cやフルラベル(^<13>C,^<15>N)subunit cの合成が可能になった。 ^<15>N-Gly subunit cをDPPCの中に再構成し、固体NMR測定をCP-MAS法を用いて測定した。この測定でシグナルが観測されたことより、今回のような精製法により得られた^<15>N-Gly subunit c試料で、固体NMR測定が可能であることが分かった。さらに、このシグナルの解析から、膜中においても有機溶媒でとっていたヘリックス構造をとっている可能性が高いことが明らかになった。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] S.Kim: "Osmotic stability of muramyl dipeptide-bearing liposomes and molecular miscibility in their membranes"Bull. Chem. Soc. Jpn.. 72. 541-548 (1999)
[文献書誌] H.Yagi: "Functional conformational changes in the TF_1 ATPase β subunit probed by twelve tyrosine residues"Biophys. J.. 77. 2175-2183 (1999)
[文献書誌] K.Fukushima: "Structural analysis of mastoparan by solid-state nuclear magnetic resonance in "Peptide Science - Present and Future" (ed. Y. Shimonishi)"Kluwer Acad. Pub.. 294-296 (1999)
[文献書誌] S.Yoshioka: "Molecular mobility of protein in lyophilized formulations linked to the molecular mobility of polymer excipients, as determined by high resolution solid-state ^<13>C NMR"Pharmaceutical Res.. 16. 1621-1625 (1999)
[文献書誌] K.Ozawa: "Evidence for the presence of F-type ATPsynthase involved in sulfate-respiration in Desulfovibrio vulgaris"J. Bacteriol.. (in press).
[文献書誌] T.Fujiwara: "Compound radio-frequency driven recoupling pulse sequences for efficient magnetization transfer by homonuclear dipolar interaction under magic angle spinning conditions"J. Magn. Reson.. (in press).
[文献書誌] 阿久津秀雄,河野敬一: "多核NMR 自然を複眼で見る"広川書店. 147 (1999)

1999 年度 実績報告書

II^4-ATP合成酵素の溶液および固体多次元NMRによる構造・機能解析

研究代表者

阿久津 秀雄 横浜国立大学, 工学部, 教授 (60029965)

研究成果

[文献書誌] S.Kim: "Osmotic stability of muramyl dipeptide-bearing liposomes and molecular miscibility in their membranes"Bull. Chem. Soc. Jpn.. 72. 541-548 (1999)

[文献書誌] H.Yagi: "Functional conformational changes in the TF_1 ATPase β subunit probed by twelve tyrosine residues"Biophys. J.. 77. 2175-2183 (1999)

[文献書誌] K.Fukushima: "Structural analysis of mastoparan by solid-state nuclear magnetic resonance in "Peptide Science - Present and Future" (ed. Y. Shimonishi)"Kluwer Acad. Pub.. 294-296 (1999)

[文献書誌] S.Yoshioka: "Molecular mobility of protein in lyophilized formulations linked to the molecular mobility of polymer excipients, as determined by high resolution solid-state ^<13>C NMR"Pharmaceutical Res.. 16. 1621-1625 (1999)

[文献書誌] K.Ozawa: "Evidence for the presence of F-type ATPsynthase involved in sulfate-respiration in Desulfovibrio vulgaris"J. Bacteriol.. (in press).

[文献書誌] T.Fujiwara: "Compound radio-frequency driven recoupling pulse sequences for efficient magnetization transfer by homonuclear dipolar interaction under magic angle spinning conditions"J. Magn. Reson.. (in press).

[文献書誌] 阿久津 秀雄,河野 敬一: "多核NMR 自然を複眼で見る"広川書店. 147 (1999)

1999 年度実績報告書

阿久津秀雄横浜国立大学, 工学部, 教授 (60029965)

[文献書誌] 阿久津秀雄,河野敬一: "多核NMR 自然を複眼で見る"広川書店. 147 (1999)