固体高分解能NMRによる膜蛋白質構造解析と機能の相関に関する新展開

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480179
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 斉藤 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (30100150)
• 研究分担者: 辻 暁 姫路工業大学, 理学部, 助手 (60227387)
• キーワード: 膜蛋白質 / バクテリオロドプシン / プロトンポンプ / NMR / 骨格構造

研究概要

バクテリオロドプシン(bR)における、光駆動プロトンポンプの分子機能の解明を目的として、野生株および種々の部位特異変異株を[1-^<13>C]Val-,[3-^<13>C]Ala-標識タンパク質を大量に調製し、それらの固体高分解能NMRスペクトルの解析から次の結果を得た。
(1) 細胞質側ループの高次構造への寄与 細胞外側にあるC末端部位がαヘリックスを形成する。このヘリックスの安定性がE-Fループの変異株A160Gにおいて著しく減少し、タンパク骨格全体のスペクトル変化をもたらし、さらにパパインによるC末端切除試料におけるこのループに構造変化がおこるところから、C末端ヘリックスはE-Fループをはじめとするループと、金属カチオンを含む塩橋形成によって相互作用を行い、タンパク質全体の安定性に寄与していることがわかった。
(2) 金属カチオンの効果 金属カチオンは、脱カチオンおよび2価金属イオンのみを除去したbRを調製し、特に2価イオンは上記の塩橋の他に細胞外側F-Gループにより選択的な結合場所をもち、タンパク質骨格の安定性に寄与していることがわかった。
(3) M様中間体 D85Nの^<13>CNMR解析により、Asp85のプロトン化にともなうレチナールとの相互作用の減少により、タンパク質全体のコンホメーション変化ならびに、ms-μsオーダーの揺らぎがを生じさせ、次のステップに移行することを明らかにした。
(4) プロトン移動経路におけるコンホメーションカップリング 光反応による細胞外側へのプロトンの放出、細胞質側でのプロトンの取り込みにともなう構造変化の“スナップショットを、プロトンが移動する経路に関与するアミノ酸残基の局部的なコンホメーション変化として、関与する変異株を調べることにより、それぞれの変化を室温で調べることができた。

研究成果

• [文献書誌] S.Yamaguchi: "Stability of C-Terminal α-Helical Domain of Bacteriorhodopsin Protruding from the Membrane Surface as Studied by High-resolution Solid-state ^<13>C NMR" Journal of Biochemistry. 123. 78-86 (1998)
• [文献書誌] H.Saito: "Conformation and Dynamics of Membrane Proteins and Biological Active Peptides as Studied by High-resolution Solid-state ^<13>C NMR" Journal of Molecular Structure. 441. 231-242 (1998)
• [文献書誌] A.Naito: "Backbone Dynamics of Polycrystalline Peptides Studied by Measurements of ^<15>N NMR Lineshpes and ^<13>C Transverse Relaxation Times" Journal of Molecular Structure. 441. 137-148 (1998)
• [文献書誌] M.Kamihira: "A High-resolution Solid-state ^<13>C and ^<15>N NMR Study on Crystalline Leu and Met-enkephalin Distinctionf Polymorphs,Backbone Dynamics and Local Conformational" Journal of Physical Chemistry B. 102. 2826-2834 (1998)
• [文献書誌] A.K.Dioumaev: "Existence of a Proton Transter Chain in Bacteriorhodopsin:Participation of Glu 194 in the Release of Protons to the Extracelluar Surface" Biochemistry. 37. 2496-2506 (1998)
• [文献書誌] T.Iwasa: "^<19>.F-NMR and UV-Vis Absorption Spectroscopic Studies of Fluorinated Octopus Rhodopsin and Its Photoproducts" Journal of Physical Chemistry A. 102. 5602-5610 (1998)
• [文献書誌] H.Saito,S.Tuzi and A.Naito: "Annual Report on NMR Spectroscopy,Vol.36" Academic Press,London,UK, 44 (1998)
• [文献書誌] H.Saito,S.Tuzi and A.Naito: "Solid State NMR of Polymers" Elesevior,Amsterdam,The Netherland, 28 (1998)