固体高分解能NMRによる膜蛋白質構造解析と機能の相関に関する新展開

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480179
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 斉藤 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (30100150)
• 研究分担者: 辻 暁 姫路工業大学, 理学部, 助手 (60227387)
• キーワード: 膜蛋白質 / バクテリオロドプシン / プロトンポンプ / NMR / 表面ダイナミックス

研究概要

バクテリオロドプシン(bR)を典型的な膜蛋白質としてとりあげ、そのフラグメントの一部を化学合成するとともに、野生株および部位特異変異株の[2-^<13>C]-,[1-^<13>C]-,[1,2,3-^<13>C_3]-Alaおよび[1-^<13>C]Val-標識蛋白質を、これら安定同位体によって置換した人工培地を用いて大量調整を行い、固体高分解能NMRスペクトル測定をもとに、以下の結果を得ることが出来た。
(1)フラグメントの化学合成 膜貫通αへリックスを含む種々の^<13>C標識フラグメントを化学合成し、脂質二重膜にうめこみ固相のスペクトルデータと比較し、膜中での遅い異方的な揺らぎ運動の存在によって、α_<II>へリックス様の挙動が見られることを明らかにした。
(2)スペクトル分解能と同位体標識位置 これまでに研究を積み重ねてきた[3-^<13>C]Ala標識bR試料にくらべて、今回の実験から得られたbRの^<13>CNMRスペクトルの分解能は、特にループ部位のように信号が完全に消滅するか、膜貫通αへリックスのようにその線幅の拡がりが著しいことがわかった。これらは、標識位置にある炭素の化学シフト異方性が数kHz程度で、これらを平均化するのに必要なマジック角回転に干渉したり、スピン-スピン緩和時間の短縮がその原因であることがわかった。
(3)膜表面残基の構造とダイナミックス 前項の結果、ループ部位は従来考えられていたような静的な構造ではなく、10kHz程度で揺らいでいる構造であることがわかった。また、C末端αへリックスがC末端に存在することは既に報告しているが、その揺らぎの相関時間をスピン格子緩和時間およびスピンスピン緩和時間の測定値から推定することができた。また、膜貫通αへリックス構造もふくめ、プロトンデカップリング周波数と干渉するもう一つの揺らぎの検出の可能性を検討した。このC末端へリックスと細胞質ループの間の相互作用についても、種々の変異株のスペクトルパターンの変化から議論することができた。

研究成果

• [文献書誌] S.Tuzi: "Localization of a cation binding site in the loop between helices F and G of bacteriorhodopsin as studied by ^<13>C NMR"Biophysical Journal. 76. 1523-1531
• [文献書誌] M.Kamihira: "Phenyl ring dynamics of enkephalin molecules and behavir of bound solventss in the crystalline state by ^2H NMR spectroscopy"Journal of Physical Chemistry,A.. 103. 3356-3363
• [文献書誌] M.Tanio: "Long-distance effects of site-directed mutations on backbone conformation in bacteriorhodopsin from solid state NMR of [1-^<13>C]Val-labeled proteins"Biophysical Journal. 77. 431-442
• [文献書誌] M.Tanio: "Conformational changes of bacteriorhodopsin along the proton-conductance chain as studied with ^<13>C NMR of [3-^<13>C]Ala-labeled protein:Arg 82 may function as information mediator"Biophysical Journal. 77. 1577-1584
• [文献書誌] K.Nishimura: "Analysis of dipolar dephasing pattern in I-S_n multispin system for obtaining the information of molecular packing and its application to crystalline N-acetyl-Pro-Gly-Phe by REDOR solid state NMR"Journal of Physical Chemistry B. 103. 8398-8408
• [文献書誌] S.Yamaguchi: "Irreversible conformational change of bacteri-opsin induced by binding of the retinal in the in vitro folding to bacteriorhodopsin as studied by ^<13>C NMR"Journal of Biochemistry(Tokyo). (in press).
• [文献書誌] M.Kamihira: "Conformational transitions and fibrillaation mechanism of human carcitonin as studied high resolution solid state ^<13>C NMR"Protein Science,. (in Press).
• [文献書誌] A.Naito: "Conformation and dynamics of mellitin bound to magnetically oriented lipid bilayers solid state ^<13>C NMR"Biophysical Journal.
• [文献書誌] H,Saito: "Conformation and backbone dynamics of bacteriorhodopsin as Revealed by ^<13>C NMR"Biochimica et Biophysica Acta. (in Press).
• [文献書誌] M.Kamihira: "Peptide Science 1998"Protein Research Foundation. 337-340
• [文献書誌] M.Kamihira: "Peptide Science 1998"Protein Research Foundation. 85-88